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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 转录组测序所需RNA提取
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guxiao1990

新虫 (初入文坛)

[求助] 转录组测序所需RNA提取

各位大神，我现在要做西兰花转录组测序，需要自己提RNA，要求质量很高，提的总是达不到要求，而且貌似杂质很多，有没有什么好的方法解决，或者好的试剂盒？谢谢了哈~
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1楼2013-03-09 13:24:35
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gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待小丽姐的精彩。 2013-06-30 15:34:54
降解并且有dna污染。
用的tips和离心管，是RNase-free的吗？可以直接买Axygen的，也不贵。
操作的时候要快，并且氯仿，异丙醇提前预冷。
如果有条件，可以用液氮提取法
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5楼2013-03-12 08:34:10
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gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by guxiao1990 at 2013-03-12 15:51:44
离心管枪头都买的RNASE-free的，网上说的各种要注意的基本都注意了，是步骤有问题么？...

材料新鲜么？
之前有过成功提取经验否？
所有的离心步骤都是4度么？
溶解RNA的水是怎么弄的，可以买个Nuclease-free water， Ambion有售
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8楼2013-03-12 17:57:28
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shucanwei

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

这个还真变态的。我提取同个物种3个阶段的样品，要使用不同的提取方法的。
用了TAKARA的RNAzol和Omega的盒子。
多试几种盒子吧，看看takara的怎么样。
TAKARA的盒子提取时我用LiCl作为沉淀剂，不能用异丙醇。
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唯以一人治天下，不以天下奉一人。
10楼2013-06-30 08:58:45
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普通回帖

gaoyang636

木虫 (著名写手)
其实不要太担心，没有要求那么变态。你能分享一下你提取步骤么？最好能贴个胶图一起看看。
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2楼2013-03-09 14:56:50
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guxiao1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaoyang636 at 2013-03-09 14:56:50
其实不要太担心，没有要求那么变态。你能分享一下你提取步骤么？最好能贴个胶图一起看看。

这两张图是两次做的，第一张从左到右是marker，拟南芥RNA，西兰花RNA；第二章从右到左是marker，西兰花RNA，拟南芥RNA。 拟南芥的两次都有带，就是带不亮，但是西兰花的基本就看不到带，第二次的还特别亮一大堆不知道是什么东西。

提取步骤：
1.50-100mg加1ml trizol匀浆器研磨，室温静置5min；
2.加0.2ml氯仿，剧烈摇晃15s，室温静置5min，12000rmp4度离心5min；
3.取上层水相转入新EP管，加入0.5ml异丙醇，混匀放于-20度1h，12000rmp离心10min；
4.倒掉上清，加现配预冷1ml75%乙醇震荡洗涤一次，7500rmp离心5min；
5.倒掉上清，晾干，加20uldepc水溶解。

麻烦您分析下到底是什么问题。。。。。

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3楼2013-03-11 14:05:09
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ahnuzc

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
guxiao1990(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待小丽姐的精彩。 2013-06-30 15:34:41
RNA降解了，注意提取的过程戴手套，勤换手套，要有专门的地方提取RNA。试剂，仪器，耗材，应该都是无RNA酶的。可以选择DEPC水去RNA酶，也可以买无酶的耗材。
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4楼2013-03-11 16:11:23
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guxiao1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ahnuzc at 2013-03-11 16:11:23
RNA降解了，注意提取的过程戴手套，勤换手套，要有专门的地方提取RNA。试剂，仪器，耗材，应该都是无RNA酶的。可以选择DEPC水去RNA酶，也可以买无酶的耗材。

基本上这些都注意了啊，步骤有问题么？
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6楼2013-03-12 15:50:51
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guxiao1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gaoyang636 at 2013-03-12 08:34:10
降解并且有dna污染。
用的tips和离心管，是RNase-free的吗？可以直接买Axygen的，也不贵。
操作的时候要快，并且氯仿，异丙醇提前预冷。
如果有条件，可以用液氮提取法

离心管枪头都买的RNASE-free的，网上说的各种要注意的基本都注意了，是步骤有问题么？
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7楼2013-03-12 15:51:44
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guxiao1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by gaoyang636 at 2013-03-12 17:57:28
材料新鲜么？
之前有过成功提取经验否？
所有的离心步骤都是4度么？
溶解RNA的水是怎么弄的，可以买个Nuclease-free water， Ambion有售...

材料都是新取液氮速冻立刻就提了，对了，提完的RNA泛红，是什么情况？含多酚么？
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9楼2013-03-12 21:59:54
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