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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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guxiao1990

新虫 (初入文坛)

[求助] 转录组测序所需RNA提取

各位大神,我现在要做西兰花转录组测序,需要自己提RNA,要求质量很高,提的总是达不到要求,而且貌似杂质很多,有没有什么好的方法解决,或者好的试剂盒?谢谢了哈~
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gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。期待小丽姐的精彩。 2013-06-30 15:34:54
降解并且有dna污染。
用的tips和离心管,是RNase-free的吗?可以直接买Axygen的,也不贵。
操作的时候要快,并且氯仿,异丙醇提前预冷。
如果有条件,可以用液氮提取法
5楼2013-03-12 08:34:10
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gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by guxiao1990 at 2013-03-12 15:51:44
离心管枪头都买的RNASE-free的,网上说的各种要注意的基本都注意了,是步骤有问题么?...

材料新鲜么?
之前有过成功提取经验否?
所有的离心步骤都是4度么?
溶解RNA的水是怎么弄的,可以买个Nuclease-free water, Ambion有售
8楼2013-03-12 17:57:28
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shucanwei

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

这个还真变态的。我提取同个物种3个阶段的样品,要使用不同的提取方法的。
用了TAKARA的RNAzol和Omega的盒子。
多试几种盒子吧,看看takara的怎么样。
TAKARA的盒子提取时我用LiCl作为沉淀剂,不能用异丙醇。
唯以一人治天下,不以天下奉一人。
10楼2013-06-30 08:58:45
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普通回帖

gaoyang636

木虫 (著名写手)

其实不要太担心,没有要求那么变态。你能分享一下你提取步骤么?最好能贴个胶图一起看看。
2楼2013-03-09 14:56:50
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guxiao1990

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gaoyang636 at 2013-03-09 14:56:50
其实不要太担心,没有要求那么变态。你能分享一下你提取步骤么?最好能贴个胶图一起看看。

这两张图是两次做的,第一张从左到右是marker,拟南芥RNA,西兰花RNA;第二章从右到左是marker,西兰花RNA,拟南芥RNA。 拟南芥的两次都有带,就是带不亮,但是西兰花的基本就看不到带,第二次的还特别亮一大堆不知道是什么东西。

提取步骤:
1.50-100mg加1ml trizol匀浆器研磨,室温静置5min;
2.加0.2ml氯仿,剧烈摇晃15s,室温静置5min,12000rmp4度离心5min;
3.取上层水相转入新EP管,加入0.5ml异丙醇,混匀放于-20度1h,12000rmp离心10min;
4.倒掉上清,加现配预冷1ml75%乙醇震荡洗涤一次,7500rmp离心5min;
5.倒掉上清,晾干,加20uldepc水溶解。

麻烦您分析下到底是什么问题。。。。。

rna   2013  3  6.jpg



rna   2013  3  8.jpg

3楼2013-03-11 14:05:09
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ahnuzc

木虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
guxiao1990(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。期待小丽姐的精彩。 2013-06-30 15:34:41
RNA降解了,注意提取的过程戴手套,勤换手套,要有专门的地方提取RNA。试剂,仪器,耗材,应该都是无RNA酶的。可以选择DEPC水去RNA酶,也可以买无酶的耗材。
4楼2013-03-11 16:11:23
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guxiao1990

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by ahnuzc at 2013-03-11 16:11:23
RNA降解了,注意提取的过程戴手套,勤换手套,要有专门的地方提取RNA。试剂,仪器,耗材,应该都是无RNA酶的。可以选择DEPC水去RNA酶,也可以买无酶的耗材。

基本上这些都注意了啊,步骤有问题么?
6楼2013-03-12 15:50:51
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guxiao1990

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by gaoyang636 at 2013-03-12 08:34:10
降解并且有dna污染。
用的tips和离心管,是RNase-free的吗?可以直接买Axygen的,也不贵。
操作的时候要快,并且氯仿,异丙醇提前预冷。
如果有条件,可以用液氮提取法

离心管枪头都买的RNASE-free的,网上说的各种要注意的基本都注意了,是步骤有问题么?
7楼2013-03-12 15:51:44
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guxiao1990

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by gaoyang636 at 2013-03-12 17:57:28
材料新鲜么?
之前有过成功提取经验否?
所有的离心步骤都是4度么?
溶解RNA的水是怎么弄的,可以买个Nuclease-free water, Ambion有售...

材料都是新取液氮速冻立刻就提了,对了,提完的RNA泛红,是什么情况?含多酚么?
9楼2013-03-12 21:59:54
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