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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 全长基因表达，关于酶切位点，关于ORF
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十三-小样

铜虫 (小有名气)

[求助] 全长基因表达，关于酶切位点，关于ORF

我拿到的基因有2700bp左右，ORF大概在500-1900这个位置。我想表达这个基因，我该如何设计上下游引物，离ORF外测多远？还是越近越好？再弱弱的问一句：酶切位点是目的序列上本来就有还是设计引物的时候认为加上去的？
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走好眼前每一步
1楼 2013-05-09 16:49:44
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
十三-小样(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-10 08:29:01
十三-小样: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-05-10 09:32:19
您是什么意思？表达基因？完整的基因？

若是完整的基因，当然是整个ORF全长啦。从ATG到终止密码子这全部。就卡这一段，碱基必须一个不多一个不少。

在这，您这酶切位点是用来干嘛的？若是为以后连载体用的，就是在加在引物的5‘端之前。具体的方法你找找酶切引物设计方面的资料，上面肯定很详细的介绍如何设计。别忘了加保护碱基。。。
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2楼2013-05-09 23:10:19
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zhaolf

木虫 (著名写手)

胖虎爱唱歌

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
十三-小样: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-05-10 11:12:18
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-05-10 13:03:50
引用回帖:
3楼: Originally posted by 十三-小样 at 2013-05-09 17:32:11
我的意思就是拿到一个新基因嘛，不是想要表达蛋白嘛。基因应该是完整的了。至少肯定包含完整的ORF。全长2700bp。ORF大概500---2000这位置。我想问的是该在什么位置设计引物回收DNA来来接载体表达蛋白。当然在ORF外 ...

看样子ORF的全序列并没有确定啊。如果有了ORF的完整序列，设计的引物就从ATG开始，到TGG(TGA,TAG)结束。确保你克隆出来的片段只是ORF的全长，两端加酶切位点，酶切位点的选择要保证使用的酶不会切开你的ORF片段，但是在载体上可以使用。
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我是胖虎，我是孩子王！
4楼2013-05-10 10:35:49
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十三-小样

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 新人小玥 at 2013-05-09 23:10:19
您是什么意思？表达基因？完整的基因？

若是完整的基因，当然是整个ORF全长啦。从ATG到终止密码子这全部。就卡这一段，碱基必须一个不多一个不少。

在这，您这酶切位点是用来干嘛的？若是为以后连载体用的，就 ...

我的意思就是拿到一个新基因嘛，不是想要表达蛋白嘛。基因应该是完整的了。至少肯定包含完整的ORF。全长2700bp。ORF大概500---2000这位置。我想问的是该在什么位置设计引物回收DNA来来接载体表达蛋白。当然在ORF外，是不是正好在外面？或者离得越近越好？还有就是要确保ORF里面没有的添加的酶切位点。
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走好眼前每一步
3楼2013-05-10 09:32:11
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十三-小样

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by zhaolf at 2013-05-10 10:35:49
看样子ORF的全序列并没有确定啊。如果有了ORF的完整序列，设计的引物就从ATG开始，到TGG(TGA,TAG)结束。确保你克隆出来的片段只是ORF的全长，两端加酶切位点，酶切位点的选择要保证使用的酶不会切开你的ORF片段，但 ...

谢谢了，我的ORF是确定的，532-2040.这样子的话我就直接选ORF两端做上下游引物，然后再在引物5端添加酶切位点是吗？要是引物质量不好不能P出ORF呢？还有我在引物两端添加酶切位点，产物就会有该酶切位点吗？我只需找出ORF里面有的酶切位点，避开他们，直接在引物5端添加上酶切位点就可以了吗？有点糊涂，谢谢指点。
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走好眼前每一步
5楼2013-05-10 11:12:00
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zhaolf

木虫 (著名写手)

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★ ★
十三-小样(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-05-15 03:06:56
引用回帖:
5楼: Originally posted by 十三-小样 at 2013-05-09 19:12:00
谢谢了，我的ORF是确定的，532-2040.这样子的话我就直接选ORF两端做上下游引物，然后再在引物5端添加酶切位点是吗？要是引物质量不好不能P出ORF呢？还有我在引物两端添加酶切位点，产物就会有该酶切位点吗？我只需 ...

1.这样子的话我就直接选ORF两端做上下游引物，然后再在引物5端添加酶切位点是吗？
是的。
2.要是引物质量不好不能P出ORF呢？
引物可以稍微设计长一点，应该没有问题。
3.还有我在引物两端添加酶切位点，产物就会有该酶切位点吗？
是的，酶切位点就自动加在PCR产物上了。
4.我只需找出ORF里面有的酶切位点，避开他们，直接在引物5端添加上酶切位点就可以了吗？
是的。酶切位点两侧再加2-3个保护碱基，比如CG.这样可以提高PCR产物的酶切效率。载体和PCR产物都酶切过后就可以做连接了。
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6楼2013-05-10 13:33:35
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十三-小样

铜虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by zhaolf at 2013-05-10 13:33:35
1.这样子的话我就直接选ORF两端做上下游引物，然后再在引物5端添加酶切位点是吗？
是的。
2.要是引物质量不好不能P出ORF呢？
引物可以稍微设计长一点，应该没有问题。
3.还有我在引物两端添加酶切位点，产物就 ...

你好，我问了一个老师，说想要表达的话光有ORF可能不行，还要ORF前面的 Kozak sequence等等一段序列，是这样的吗
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走好眼前每一步
7楼2013-05-14 10:58:54
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十三-小样

铜虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by zhaolf at 2013-05-10 13:33:35
1.这样子的话我就直接选ORF两端做上下游引物，然后再在引物5端添加酶切位点是吗？
是的。
2.要是引物质量不好不能P出ORF呢？
引物可以稍微设计长一点，应该没有问题。
3.还有我在引物两端添加酶切位点，产物就 ...

据说在ORF前面还有一些有用的不可少的功能原件，只有ORF可能不能表达成功。
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走好眼前每一步
8楼2013-05-14 11:02:09
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zhaolf

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十三-小样(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-05-15 03:07:22
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7楼: Originally posted by 十三-小样 at 2013-05-13 18:58:54
你好，我问了一个老师，说想要表达的话光有ORF可能不行，还要ORF前面的 Kozak sequence等等一段序列，是这样的吗...

是的，你应该听这个老师的。因为我做的都是只需要在细菌里表达，是不需要这段序列的，但是别的情况是有需要的。我以前用gateway 系统的时候手册里有提到：Inclusion of the Shine-Dalgarno and Kozak consensus sequence allows protein expression in both E. coli and mammalian cells. 另外也要看你表达的载体是怎样的。具体情况具体分析。
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9楼2013-05-15 02:52:52
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十三-小样

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhaolf at 2013-05-15 02:52:52
是的，你应该听这个老师的。因为我做的都是只需要在细菌里表达，是不需要这段序列的，但是别的情况是有需要的。我以前用gateway 系统的时候手册里有提到：Inclusion of the Shine-Dalgarno and Kozak consensus se ...

我也是想用大肠杆菌表达而已，另外有人说这个蛋白表达来也没活性，是包涵体蛋白。但是不管能不能成功，有没有活性，我都想试试，给老师也有个交代，实在不行再拿去公司表达。这样子我用大肠杆菌表达的话只要ORF段就行了吗？用两头做引物25个碱基长度得分80分左右，还过得去，但是Tm偏高，我准备试一下不同长度。
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10楼2013-05-15 08:35:23
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