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十三-小样

铜虫 (小有名气)

[求助] 全长基因表达,关于酶切位点,关于ORF

我拿到的基因有2700bp左右,ORF大概在500-1900这个位置。我想表达这个基因,我该如何设计上下游引物,离ORF外测多远?还是越近越好?再弱弱的问一句:酶切位点是目的序列上本来就有还是设计引物的时候认为加上去的?
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走好眼前每一步
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十三-小样

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by zhaolf at 2013-05-15 02:52:52
是的,你应该听这个老师的。因为我做的都是只需要在细菌里表达,是不需要这段序列的,但是别的情况是有需要的。我以前用gateway 系统的时候手册里有提到:Inclusion of the Shine-Dalgarno and Kozak consensus se ...

我也是想用大肠杆菌表达而已,另外有人说这个蛋白表达来也没活性,是包涵体蛋白。但是不管能不能成功,有没有活性,我都想试试,给老师也有个交代,实在不行再拿去公司表达。这样子我用大肠杆菌表达的话只要ORF段就行了吗?用两头做引物25个碱基长度得分80分左右,还过得去,但是Tm偏高,我准备试一下不同长度。
走好眼前每一步
10楼2013-05-15 08:35:23
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
十三-小样(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-10 08:29:01
十三-小样: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-05-10 09:32:19
您是什么意思?表达基因?完整的基因?

若是完整的基因,当然是整个ORF全长啦。从ATG到终止密码子这全部。就卡这一段,碱基必须一个不多一个不少。

在这,您这酶切位点是用来干嘛的?若是为以后连载体用的,就是在加在引物的5‘端之前。具体的方法你找找酶切引物设计方面的资料,上面肯定很详细的介绍如何设计。别忘了加保护碱基。。。

2楼2013-05-09 23:10:19
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十三-小样

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 新人小玥 at 2013-05-09 23:10:19
您是什么意思?表达基因?完整的基因?

若是完整的基因,当然是整个ORF全长啦。从ATG到终止密码子这全部。就卡这一段,碱基必须一个不多一个不少。

在这,您这酶切位点是用来干嘛的?若是为以后连载体用的,就 ...

我的意思就是拿到一个新基因嘛,不是想要表达蛋白嘛。基因应该是完整的了。至少肯定包含完整的ORF。全长2700bp。ORF大概500---2000这位置。我想问的是该在什么位置设计引物回收DNA来来接载体表达蛋白。当然在ORF外,是不是正好在外面?或者离得越近越好?还有就是要确保ORF里面没有的添加的酶切位点。
走好眼前每一步
3楼2013-05-10 09:32:11
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zhaolf

木虫 (著名写手)

胖虎爱唱歌

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
十三-小样: 金币+4, ★★★很有帮助 2013-05-10 11:12:18
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-05-10 13:03:50
引用回帖:
3楼: Originally posted by 十三-小样 at 2013-05-09 17:32:11
我的意思就是拿到一个新基因嘛,不是想要表达蛋白嘛。基因应该是完整的了。至少肯定包含完整的ORF。全长2700bp。ORF大概500---2000这位置。我想问的是该在什么位置设计引物回收DNA来来接载体表达蛋白。当然在ORF外 ...

看样子ORF的全序列并没有确定啊。如果有了ORF的完整序列,设计的引物就从ATG开始,到TGG(TGA,TAG)结束。确保你克隆出来的片段只是ORF的全长,两端加酶切位点,酶切位点的选择要保证使用的酶不会切开你的ORF片段,但是在载体上可以使用。
我是胖虎,我是孩子王!
4楼2013-05-10 10:35:49
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