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全长基因表达，关于酶切位点，关于ORF
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| 我拿到的基因有2700bp左右，ORF大概在500-1900这个位置。我想表达这个基因，我该如何设计上下游引物，离ORF外测多远？还是越近越好？再弱弱的问一句：酶切位点是目的序列上本来就有还是设计引物的时候认为加上去的？ |
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zhaolf
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十三-小样(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-05-15 03:06:56
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1.这样子的话我就直接选ORF两端做上下游引物，然后再在引物5端添加酶切位点是吗？ 是的。 2.要是引物质量不好不能P出ORF呢？ 引物可以稍微设计长一点，应该没有问题。 3.还有我在引物两端添加酶切位点，产物就会有该酶切位点吗？ 是的，酶切位点就自动加在PCR产物上了。 4.我只需找出ORF里面有的酶切位点，避开他们，直接在引物5端添加上酶切位点就可以了吗？ 是的。酶切位点两侧再加2-3个保护碱基，比如CG.这样可以提高PCR产物的酶切效率。载体和PCR产物都酶切过后就可以做连接了。 |
6楼2013-05-10 13:33:35
新人小玥
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【答案】应助回帖
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十三-小样(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-10 08:29:01
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您是什么意思？表达基因？完整的基因？ 若是完整的基因，当然是整个ORF全长啦。从ATG到终止密码子这全部。就卡这一段，碱基必须一个不多一个不少。 在这，您这酶切位点是用来干嘛的？若是为以后连载体用的，就是在加在引物的5‘端之前。具体的方法你找找酶切引物设计方面的资料，上面肯定很详细的介绍如何设计。别忘了加保护碱基。。。  |
2楼2013-05-09 23:10:19
3楼2013-05-10 09:32:11
zhaolf
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4楼2013-05-10 10:35:49
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