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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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azad2013

银虫 (初入文坛)

[求助] 关于PCR与测序

最近在做基因克隆与测序，步骤如下：
1.设计简并引物
2.菌液PCR，目的基因割胶回收
3.目的基因与载体连接
4.将载体转化到感受态大肠杆菌
5.Amp平板筛选，将长出的菌落再次做PCR，跑胶看载体是否连入正确的目的基因
6.将连有目的基因的菌液送去测序
我的问题来了：不能将连有目的基因的PCR液送去测序么？如果嫌液体太少，稀释啊，反正PCR完后浓度应该相当大。(PCR使用的是载体的引物进行的，这样送去测序应该不影响目的基因啊)

[ Last edited by azad2013 on 2013-3-4 at 08:23 ]
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1楼 2013-03-04 08:17:17
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
你指的哪一步？
菌液PCR那步肯定不能测序的
最后一步也没什么区别了。
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2楼2013-03-04 08:35:16
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gaojuan1985

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR的产物是可以拿去测序的，但通常成功率没有质粒测序高，所以不这么做。
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3楼2013-03-04 09:12:43
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
一般测序是在PCR产物测序那步，不过你也可以再你说的第六步进行测序，直接送菌液就可以了，1ml足以。另外你的目的基因连接到载体上，利用载体上的测序引物进行测序是完全没有问题的。
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生物化学与分子生物学
4楼2013-03-04 10:44:51
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lihuan0525

金虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主我就是做测序出来的，你可以直接把菌液拿给测序公司就行，PCR也可以，质粒也行，收费都一样，楼主考虑吧。
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5楼2013-03-04 14:39:00
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azad2013

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lihuan0525 at 2013-03-04 14:39:00
楼主我就是做测序出来的，你可以直接把菌液拿给测序公司就行，PCR也可以，质粒也行，收费都一样，楼主考虑吧。

但有些说，PCR的只能部分测序?那关于送去溶液的量有什么要求么？
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3427256&page=1
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6楼2013-03-04 17:16:02
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azad2013

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lidonghong at 2013-03-04 10:44:51
一般测序是在PCR产物测序那步，不过你也可以再你说的第六步进行测序，直接送菌液就可以了，1ml足以。另外你的目的基因连接到载体上，利用载体上的测序引物进行测序是完全没有问题的。

那PCR的液体呢，不过它的体系一般就几十微升？
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7楼2013-03-04 17:17:58
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by azad2013 at 2013-03-04 17:17:58
那PCR的液体呢，不过它的体系一般就几十微升？...

PCR产物测序25ul也是可以的，50ul足以。
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生物化学与分子生物学
8楼2013-03-05 08:15:04
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静安jingan

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
pcr可以直接测序的啊，通常会菌液和质粒一起测序
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让复杂的事情变简单，简单的事情更简单
9楼2013-03-05 10:20:10
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冷酷的JING

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
切胶后将剩下的PCR液送测，如果测序失败再回收胶做连接转化，省时又双重保险
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10楼2013-03-06 09:19:24
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