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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物再次PCR无条带 只有弥散
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Hopig

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物再次PCR无条带 只有弥散

如图所示，左边是两道marker（DL2000和wide range），前四个样是一次PCR的产物，目的大小是3K，总见不着带。然后就把PCR产物稀释1000倍，进行再次PCR，就出现了大片段的弥散，就是图中后四个样。一开始以为稀释倍数不够，还试过10000倍和100000倍，结果类似，弥散稍微弱一些，但是集中的条带还是很大。求高人指点，这到底为啥啊？？？如何改进，才能获得清晰的单带啊？

20130227.jpg
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1楼 2013-03-01 12:31:02
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

chenguestc

木虫 (职业作家)
先把DNA跑个胶看下质量和大体浓度，如果是DNA问题则换新DNA，如果DNA没有问题就调整引物浓度和退火温度试试，如果还不行，就换其他引物把，可能是引物确实不特异。每一步都加阴阳对照最好。
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13楼2013-03-05 09:12:16
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普通回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
试试提高退火温度，降低引物浓度，加入DMSO等方法。前两者或者能解决问题。
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2楼2013-03-01 12:52:56
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潇之天下

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
第一，检测PCR模板；第二，提高退火温度以增加特异性；第三，梯度稀释，同时设阴性和阳性对照。
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修行人
3楼2013-03-01 12:59:18
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Hopig

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2013-03-01 12:52:56
试试提高退火温度，降低引物浓度，加入DMSO等方法。前两者或者能解决问题。

这就做上试试~谢！
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4楼2013-03-01 21:06:54
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Hopig

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 潇之天下 at 2013-03-01 12:59:18
第一，检测PCR模板；第二，提高退火温度以增加特异性；第三，梯度稀释，同时设阴性和阳性对照。

怎么检测PCR模板？您是指哪一步的模板啊？谢谢~
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5楼2013-03-01 21:07:34
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潇之天下

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by Hopig at 2013-03-01 21:07:34
怎么检测PCR模板？您是指哪一步的模板啊？谢谢~...

您的第一次PCR产物是通过，RT-PCR获得的吗？如果是，电泳检测下RNA的完整性。
左边一次PCR产物特异性太差了，直接弥散了，估计可能是模板RNA或者引物设计的问题。
最好详细说下你的实验过程。希望对你有帮助吧！
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修行人
6楼2013-03-02 12:26:43
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Hopig

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 潇之天下 at 2013-03-02 12:26:43
您的第一次PCR产物是通过，RT-PCR获得的吗？如果是，电泳检测下RNA的完整性。
左边一次PCR产物特异性太差了，直接弥散了，估计可能是模板RNA或者引物设计的问题。
最好详细说下你的实验过程。希望对你有帮助吧！...

我第一次PCR的模板直接就是DNA。产物大小3k，有小片段的弥散，应该无所谓吧。问题是这样的，之前扩增的产物很好，但就成功了一次，结果送测序还失败了，之后扩增就没有明显的条带了，所以才想二次PCR。
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7楼2013-03-02 15:32:20
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Hopig

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2013-03-01 12:52:56
试试提高退火温度，降低引物浓度，加入DMSO等方法。前两者或者能解决问题。

您好~我今天做了检测~提高退火温度，设置的梯度，一直提了8℃，还是一样的弥散。其实我很好奇，为什么会有那么多的大片段呢？
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8楼2013-03-02 15:34:20
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潇之天下

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
Hopig: 金币+1, ★有帮助, 还是很感谢~ 2013-03-04 11:21:12
引用回帖:
7楼: Originally posted by Hopig at 2013-03-02 15:32:20
我第一次PCR的模板直接就是DNA。产物大小3k，有小片段的弥散，应该无所谓吧。问题是这样的，之前扩增的产物很好，但就成功了一次，结果送测序还失败了，之后扩增就没有明显的条带了，所以才想二次PCR。...

二次PCR，加样孔都有带，真搞不懂这个基因的序列是要闹哪样。
敢问这个一次PCR的模板DNA存了多久了，怎么储存的？
直接提的基因组DNA，有弥散属于正常，第一次PCR富集后，还是弥散，而且引物被耗尽的话，可能就是引物的问题了。
你在网上多查查吧。
知识有限，爱莫能助。祝君顺利！
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修行人
9楼2013-03-02 22:49:16
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studentg

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
觉得引物特异性不够，改进一下引物，提高退火温度。
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道法自然，探其精妙。
10楼2013-03-04 00:57:51
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