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Hopig

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物再次PCR无条带 只有弥散

如图所示,左边是两道marker(DL2000和wide range),前四个样是一次PCR的产物,目的大小是3K,总见不着带。然后就把PCR产物稀释1000倍,进行再次PCR,就出现了大片段的弥散,就是图中后四个样。一开始以为稀释倍数不够,还试过10000倍和100000倍,结果类似,弥散稍微弱一些,但是集中的条带还是很大。求高人指点,这到底为啥啊???如何改进,才能获得清晰的单带啊?

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Hopig

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 潇之天下 at 2013-03-01 12:59:18
第一,检测PCR模板;第二,提高退火温度以增加特异性;第三,梯度稀释,同时设阴性和阳性对照。

怎么检测PCR模板?您是指哪一步的模板啊?谢谢~
5楼2013-03-01 21:07:34
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
试试提高退火温度,降低引物浓度,加入DMSO等方法。前两者或者能解决问题。
2楼2013-03-01 12:52:56
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潇之天下

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
第一,检测PCR模板;第二,提高退火温度以增加特异性;第三,梯度稀释,同时设阴性和阳性对照。
修行人
3楼2013-03-01 12:59:18
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Hopig

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2013-03-01 12:52:56
试试提高退火温度,降低引物浓度,加入DMSO等方法。前两者或者能解决问题。

这就做上试试~谢!
4楼2013-03-01 21:06:54
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