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Hopig

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物再次PCR无条带 只有弥散

如图所示,左边是两道marker(DL2000和wide range),前四个样是一次PCR的产物,目的大小是3K,总见不着带。然后就把PCR产物稀释1000倍,进行再次PCR,就出现了大片段的弥散,就是图中后四个样。一开始以为稀释倍数不够,还试过10000倍和100000倍,结果类似,弥散稍微弱一些,但是集中的条带还是很大。求高人指点,这到底为啥啊???如何改进,才能获得清晰的单带啊?

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chenguestc

木虫 (职业作家)

先把DNA跑个胶看下质量和大体浓度,如果是DNA问题则换新DNA,如果DNA没有问题就调整引物浓度和退火温度试试,如果还不行,就换其他引物把,可能是引物确实不特异。每一步都加阴阳对照最好。
13楼2013-03-05 09:12:16
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普通回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
试试提高退火温度,降低引物浓度,加入DMSO等方法。前两者或者能解决问题。
2楼2013-03-01 12:52:56
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潇之天下

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
第一,检测PCR模板;第二,提高退火温度以增加特异性;第三,梯度稀释,同时设阴性和阳性对照。
修行人
3楼2013-03-01 12:59:18
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Hopig

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2013-03-01 12:52:56
试试提高退火温度,降低引物浓度,加入DMSO等方法。前两者或者能解决问题。

这就做上试试~谢!
4楼2013-03-01 21:06:54
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Hopig

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 潇之天下 at 2013-03-01 12:59:18
第一,检测PCR模板;第二,提高退火温度以增加特异性;第三,梯度稀释,同时设阴性和阳性对照。

怎么检测PCR模板?您是指哪一步的模板啊?谢谢~
5楼2013-03-01 21:07:34
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潇之天下

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by Hopig at 2013-03-01 21:07:34
怎么检测PCR模板?您是指哪一步的模板啊?谢谢~...

您的第一次PCR产物是通过,RT-PCR获得的吗?如果是,电泳检测下RNA的完整性。
左边一次PCR产物特异性太差了,直接弥散了,估计可能是模板RNA或者引物设计的问题。
最好详细说下你的实验过程。希望对你有帮助吧!
修行人
6楼2013-03-02 12:26:43
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Hopig

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 潇之天下 at 2013-03-02 12:26:43
您的第一次PCR产物是通过,RT-PCR获得的吗?如果是,电泳检测下RNA的完整性。
左边一次PCR产物特异性太差了,直接弥散了,估计可能是模板RNA或者引物设计的问题。
最好详细说下你的实验过程。希望对你有帮助吧!...

我第一次PCR的模板直接就是DNA。产物大小3k,有小片段的弥散,应该无所谓吧。问题是这样的,之前扩增的产物很好,但就成功了一次,结果送测序还失败了,之后扩增就没有明显的条带了,所以才想二次PCR。
7楼2013-03-02 15:32:20
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Hopig

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2013-03-01 12:52:56
试试提高退火温度,降低引物浓度,加入DMSO等方法。前两者或者能解决问题。

您好~我今天做了检测~提高退火温度,设置的梯度,一直提了8℃,还是一样的弥散。其实我很好奇,为什么会有那么多的大片段呢?
8楼2013-03-02 15:34:20
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潇之天下

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


Hopig: 金币+1, 有帮助, 还是很感谢~ 2013-03-04 11:21:12
引用回帖:
7楼: Originally posted by Hopig at 2013-03-02 15:32:20
我第一次PCR的模板直接就是DNA。产物大小3k,有小片段的弥散,应该无所谓吧。问题是这样的,之前扩增的产物很好,但就成功了一次,结果送测序还失败了,之后扩增就没有明显的条带了,所以才想二次PCR。...

二次PCR,加样孔都有带,真搞不懂这个基因的序列是要闹哪样。
敢问这个一次PCR的模板DNA存了多久了,怎么储存的?
直接提的基因组DNA,有弥散属于正常,第一次PCR富集后,还是弥散,而且引物被耗尽的话,可能就是引物的问题了。
你在网上多查查吧。
知识有限,爱莫能助。祝君顺利!
修行人
9楼2013-03-02 22:49:16
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studentg

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
觉得引物特异性不够,改进一下引物,提高退火温度。
道法自然,探其精妙。
10楼2013-03-04 00:57:51
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