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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物再次PCR无条带 只有弥散
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Hopig

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by studentg at 2013-03-04 00:57:51
觉得引物特异性不够，改进一下引物，提高退火温度。

之前有过一次产物出奇的亮，但是之后不管怎么重复，都再也出不来亮带了~
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11楼2013-03-04 11:21:57
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haitian0625

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by Hopig at 2013-03-02 15:32:20
我第一次PCR的模板直接就是DNA。产物大小3k，有小片段的弥散，应该无所谓吧。问题是这样的，之前扩增的产物很好，但就成功了一次，结果送测序还失败了，之后扩增就没有明显的条带了，所以才想二次PCR。...

有小片段弥散，应该降低延伸温度，我曾降过4度；二次PCR后又长片段较多的话，应减少延伸时间。同时，可稍微增加些酶量。
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12楼2013-03-04 21:33:17
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chenguestc

木虫 (职业作家)
先把DNA跑个胶看下质量和大体浓度，如果是DNA问题则换新DNA，如果DNA没有问题就调整引物浓度和退火温度试试，如果还不行，就换其他引物把，可能是引物确实不特异。每一步都加阴阳对照最好。
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13楼2013-03-05 09:12:16
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Hopig

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
12楼: Originally posted by haitian0625 at 2013-03-04 21:33:17
有小片段弥散，应该降低延伸温度，我曾降过4度；二次PCR后又长片段较多的话，应减少延伸时间。同时，可稍微增加些酶量。...

这就试一下，谢谢啦~
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14楼2013-03-05 10:28:06
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zltj2008

铜虫 (小有名气)
第一次PCR就弥散。。那你用同样的引物再扩增可不就更弥散。。。
我也同意楼上的建议，先跑个电泳，看看DNA的完整程度。如果DNA没问题的话，那80%就是引物的问题，用一管新的引物或重新涉及引物吧。如果还是要做两次PCR的话，那就最好用巢式PCR。如果不愿意重新设计引物，那也可以考虑用降落PCR增加特异性。
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15楼2013-03-06 11:28:48
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歆崽崽

新虫 (初入文坛)
楼主 。。。能问一句你做出来了么 我最近也是这个问题啊
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16楼2013-09-23 16:59:12
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ssyyll1019

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 歆崽崽 at 2013-09-23 16:59:12
楼主 。。。能问一句你做出来了么 我最近也是这个问题啊

你这个问题解决了吗？
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17楼2014-03-30 18:50:45
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亦逐日

金虫 (小有名气)
本人经验，胶回收产物PCR经常如此，原因是模板浓度太小。测一下浓度，模板在10-100ng可以扩出来，你的目的条带的模板含量肯定不够
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道可道，非常道
18楼2014-12-26 11:45:30
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫
好多次都是遇到同样的问题，处理了一下模板，并换用高特异性的试剂盒高保真酶或hot start taq聚合酶扩增基本上都会出现条带
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todayisdifficult，tomorrowismoredifficult，butthedayaftertomorrowisbeautiful
19楼2015-07-20 15:59:41
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