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Hopig

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
10楼: Originally posted by studentg at 2013-03-04 00:57:51
觉得引物特异性不够,改进一下引物,提高退火温度。

之前有过一次产物出奇的亮,但是之后不管怎么重复,都再也出不来亮带了~
11楼2013-03-04 11:21:57
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haitian0625

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by Hopig at 2013-03-02 15:32:20
我第一次PCR的模板直接就是DNA。产物大小3k,有小片段的弥散,应该无所谓吧。问题是这样的,之前扩增的产物很好,但就成功了一次,结果送测序还失败了,之后扩增就没有明显的条带了,所以才想二次PCR。...

有小片段弥散,应该降低延伸温度,我曾降过4度;二次PCR后又长片段较多的话,应减少延伸时间。同时,可稍微增加些酶量。
12楼2013-03-04 21:33:17
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chenguestc

木虫 (职业作家)

先把DNA跑个胶看下质量和大体浓度,如果是DNA问题则换新DNA,如果DNA没有问题就调整引物浓度和退火温度试试,如果还不行,就换其他引物把,可能是引物确实不特异。每一步都加阴阳对照最好。
13楼2013-03-05 09:12:16
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Hopig

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
12楼: Originally posted by haitian0625 at 2013-03-04 21:33:17
有小片段弥散,应该降低延伸温度,我曾降过4度;二次PCR后又长片段较多的话,应减少延伸时间。同时,可稍微增加些酶量。...

这就试一下,谢谢啦~
14楼2013-03-05 10:28:06
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zltj2008

铜虫 (小有名气)

第一次PCR就弥散。。那你用同样的引物再扩增可不就更弥散。。。
我也同意楼上的建议,先跑个电泳,看看DNA的完整程度。如果DNA没问题的话,那80%就是引物的问题,用一管新的引物或重新涉及引物吧。如果还是要做两次PCR的话,那就最好用巢式PCR。如果不愿意重新设计引物,那也可以考虑用降落PCR增加特异性。
15楼2013-03-06 11:28:48
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歆崽崽

新虫 (初入文坛)

楼主 。。。能问一句你做出来了么 我最近也是这个问题啊
16楼2013-09-23 16:59:12
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ssyyll1019

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 歆崽崽 at 2013-09-23 16:59:12
楼主 。。。能问一句你做出来了么 我最近也是这个问题啊

你这个问题解决了吗?
17楼2014-03-30 18:50:45
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亦逐日

金虫 (小有名气)

本人经验,胶回收产物PCR经常如此,原因是模板浓度太小。测一下浓度,模板在10-100ng可以扩出来,你的目的条带的模板含量肯定不够
道可道,非常道
18楼2014-12-26 11:45:30
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18761615793

木虫 (正式写手)

小虫

好多次都是遇到同样的问题,处理了一下模板,并换用高特异性的试剂盒高保真酶hot start taq聚合酶扩增基本上都会出现条带
todayisdifficult,tomorrowismoredifficult,butthedayaftertomorrowisbeautiful
19楼2015-07-20 15:59:41
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