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Hopig

铁虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
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专业: 基因表达调控与表观遗传学

[求助] PCR产物再次PCR无条带只有弥散

如图所示，左边是两道marker（DL2000和wide range），前四个样是一次PCR的产物，目的大小是3K，总见不着带。然后就把PCR产物稀释1000倍，进行再次PCR，就出现了大片段的弥散，就是图中后四个样。一开始以为稀释倍数不够，还试过10000倍和100000倍，结果类似，弥散稍微弱一些，但是集中的条带还是很大。求高人指点，这到底为啥啊？？？如何改进，才能获得清晰的单带啊？

20130227.jpg

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1楼 2013-03-01 12:31:02

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haitian0625

金虫 (小有名气)

应助: 7 (幼儿园)
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虫号: 903890
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专业: 基因表达调控与表观遗传学

引用回帖:

7楼: Originally posted by Hopig at 2013-03-02 15:32:20
我第一次PCR的模板直接就是DNA。产物大小3k，有小片段的弥散，应该无所谓吧。问题是这样的，之前扩增的产物很好，但就成功了一次，结果送测序还失败了，之后扩增就没有明显的条带了，所以才想二次PCR。...

有小片段弥散，应该降低延伸温度，我曾降过4度；二次PCR后又长片段较多的话，应减少延伸时间。同时，可稍微增加些酶量。