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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR产物再次PCR无条带 只有弥散
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Hopig

铁虫 (初入文坛)

[求助] PCR产物再次PCR无条带 只有弥散

如图所示，左边是两道marker（DL2000和wide range），前四个样是一次PCR的产物，目的大小是3K，总见不着带。然后就把PCR产物稀释1000倍，进行再次PCR，就出现了大片段的弥散，就是图中后四个样。一开始以为稀释倍数不够，还试过10000倍和100000倍，结果类似，弥散稍微弱一些，但是集中的条带还是很大。求高人指点，这到底为啥啊？？？如何改进，才能获得清晰的单带啊？

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1楼2013-03-01 12:31:02
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潇之天下

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
Hopig: 金币+1, ★有帮助, 还是很感谢~ 2013-03-04 11:21:12
引用回帖:
7楼: Originally posted by Hopig at 2013-03-02 15:32:20
我第一次PCR的模板直接就是DNA。产物大小3k，有小片段的弥散，应该无所谓吧。问题是这样的，之前扩增的产物很好，但就成功了一次，结果送测序还失败了，之后扩增就没有明显的条带了，所以才想二次PCR。...

二次PCR，加样孔都有带，真搞不懂这个基因的序列是要闹哪样。
敢问这个一次PCR的模板DNA存了多久了，怎么储存的？
直接提的基因组DNA，有弥散属于正常，第一次PCR富集后，还是弥散，而且引物被耗尽的话，可能就是引物的问题了。
你在网上多查查吧。
知识有限，爱莫能助。祝君顺利！
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修行人
9楼2013-03-02 22:49:16
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
试试提高退火温度，降低引物浓度，加入DMSO等方法。前两者或者能解决问题。
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2楼2013-03-01 12:52:56
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潇之天下

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
第一，检测PCR模板；第二，提高退火温度以增加特异性；第三，梯度稀释，同时设阴性和阳性对照。
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修行人
3楼2013-03-01 12:59:18
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Hopig

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by chenguestc at 2013-03-01 12:52:56
试试提高退火温度，降低引物浓度，加入DMSO等方法。前两者或者能解决问题。

这就做上试试~谢！
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4楼2013-03-01 21:06:54
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