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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白质总量，变还是不变！？
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summer2771

木虫 (正式写手)

[交流] 蛋白质总量，变还是不变！？ 已有8人参与

请教大家的意见，经常可以看到论文中（包括学位论文），只做某些蛋白的磷酸化表达，而不做蛋白总量表达。是否可以理解为，某蛋白的总量跟内参一样，是相对恒定不变的，即便是有波动，但也并无显著性差异。由此则只要计算出磷酸化表达的相对量即可说明磷酸化率究竟是上升还是下调，从而表明该蛋白的变化。
我的实验中出现了有好多例都是各个组的蛋白总量也是有显著不同的，磷酸化表达也是不同的，我用磷酸化表达/总量表达的Ratio来说明问题，出现的趋势却可能是跟磷酸化、总量本身的变化趋势相反，即磷酸化、总量均上升，但是Ratio却可能是下调的。
看国外国内很多的论文，从条带上来看，基本上总量似乎是没有差异的。
我就有点纳闷了，难道我的实验出现了问题？
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1楼 2013-01-24 23:12:34
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summer2771

木虫 (正式写手)
谢谢各位战友的热心回复！
我是同时做了磷酸化与蛋白总量的，但是发现有个问题，就是我的蛋白总量也是变化的，而且具有显著性的差异，磷酸化也是有变化的，比如：某一个蛋白的蛋白总量，实验组与对照组相比，是升高的；磷酸化表达的相对倍数也是升高的；但是用磷酸化表达/蛋白总量后，比值却是下降的....
有朋友告诉我说，一般总量是不变，即变化比较小，没有显著性差异，倍数来看，可能是1.0几或者是0.9几倍，统计出来的结果是p大于0.05的。我看过的论文中，做了磷酸化与总量的，从条带来看，都是比较齐的，看不出会有显著性的差异。这是我比较纳闷的地方。毕竟磷酸化表达只是蛋白表达中很小的一部分，所以即便是磷酸化表达有变化，总量应该是相对较为恒定，没有显著性升高或降低的。
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5楼2013-01-25 11:12:38
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summer2771

木虫 (正式写手)
另外请教大家一下，是否会出现这种情况：蛋白总量呈下降趋势，比如与对照组相比倍数为0.93、0.95倍，但是磷酸化表达却是升高的比如1.1或1.2倍
这样的话，用phospho/total，出来的倍数则会大于phospho/内参所表现出的1.1或1.2倍。
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6楼2013-01-25 11:15:48
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summer2771

木虫 (正式写手)
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7楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-25 16:56:35
如果总量相对内参变化很大你就要考虑你处理的效果是不是你想要的了
可能你的处理并不是影响蛋白磷酸化水平
而是影响蛋白的表达水平

谢谢，但是磷酸化率才是反应蛋白活性的啊，如果是上面那种趋势的话，我就无法解释到底我的蛋白磷酸化率是提高了还是降低了...
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8楼2013-01-25 18:48:23
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summer2771

木虫 (正式写手)
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9楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-25 19:59:53
如果你的处理影响到了蛋白的表达水平，就没必要盯着磷酸化做文章了
如果处理组和对照，内参总蛋白水平都一致，磷酸化水平不一致，这个处理才是针对这个磷酸化位点的，不然就不能用磷酸化去解释
你上样时把内参量 ...

我做的信号通路蛋白，如果不盯着磷酸化，光总蛋白说明不了问题啊！
我跑胶的时候，磷酸化和总蛋白不是一版胶跑的，所以各自都有一个内参，但是内参都是齐的，内参效果做的挺好的。
我是做的组织，每一样本组织的蛋白含量肯定不同，但是经过调整之后，样品浓度是4ug/ul，按照20ug的量上样。
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10楼2013-01-26 00:22:09
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summer2771

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-26 04:34:42
也可以说明问题啊
如果内参不变，而蛋白总量和磷酸化水平都增高，虽然是同向的，也就是说磷酸化的比例不变，但绝对水平上来说翻译和翻译后修饰都是增高的
1.分光光度计测的不一定准，最后还是以western跑出来的内 ...

哇，你睡这么晚啊！建议你还是早点睡觉吧，当然，在国外的另当别论了。呵呵！

我所看过的论文，总量基本都是不变的，以磷酸化表达的升降来说明该蛋白的活性上调或下调，因为我一般看但的都是信号转导方面的蛋白。不知道你说的这种磷酸化率不变，但从绝对水平上来说翻译和翻译后修饰均增高能不能推荐一两篇文献看下？
我的情况跟你说的这个还不同，我的是磷酸化和总量都上升，但是如果用磷酸化/总量的磷酸化率话却是表现为下降，而不是比例不变。这个我就有点不明白，该以哪个为准，该如何解释...
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12楼2013-01-26 12:53:08
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summer2771

木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-26 04:34:42
也可以说明问题啊
如果内参不变，而蛋白总量和磷酸化水平都增高，虽然是同向的，也就是说磷酸化的比例不变，但绝对水平上来说翻译和翻译后修饰都是增高的
1.分光光度计测的不一定准，最后还是以western跑出来的内 ...

另外请教一下，是否会出现这种情况：蛋白总量呈下降趋势，比如与对照组相比倍数为0.93、0.95倍，但是磷酸化表达却是升高的比如1.1或1.2倍
这样的话，用磷酸化/总量，出来的倍数则会大于磷酸化/内参所表现出的1.1或1.2倍，比如达到1.4或1.5倍。我简单列个表在下面以方便你看：
相对倍数 对照 处理组1  处理组2
总量        1        0.93      0.95
磷酸化    1        1.20      1.10
磷/总     1        1.40       1.50
总量均值为0.93、95，一个one way anova比较均值，是无显著性差异的，所以就是所说的总量不变。但是从趋势上看，处理组的总量是下降的。但磷酸化表达都是升高的！势必最后的磷酸化/总量会升的更高。
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13楼2013-01-26 12:59:56
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summer2771

木虫 (正式写手)
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14楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-26 17:16:01
Western本身只能半定量，没有那么准的，误差不小，用来取灰度值的照片要曝光的尽量浅才能看出差异
这些数值差异都太小，磷/总应该是 1 1.29 1.16吧
要我看就是处理组总量不变磷酸化上升，我会再进行一次实验验证...

我的意思就是想问问，是不是会出现总蛋白量略减少，比如上面例子中的0.95、0.93，但是磷酸化表达却增加，为1.1或1.2的情况呢？
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15楼2013-01-26 22:44:01
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summer2771

木虫 (正式写手)
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17楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-27 04:28:40
这不是你想要的结果么？
而且0.95 0.93没有统计学意义，也不能说蛋白量减少吧...

我的一组中有好几个都是这样的，最后求均值加标准差，均值就是0.95、0.93左右，虽然没有统计学意义，但是趋势是蛋白总量减少的。但是他们的磷酸化表达均值都是升高的，我不知道会不会有这一种情况出现，在我看来，实验组与对照组相比，磷酸化表达的均值是升高的，那总量的趋势也就一定是升高的。
我觉得人家会质疑我出现的这种情况：难道总量趋势是减少的，磷酸化表达的趋势会是增加的！？
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18楼2013-01-27 19:44:08
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summer2771

木虫 (正式写手)
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19楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-30 14:25:42
哈哈，我想人家不会质疑这个吧，毕竟western只是半定量方法，差个20%可信度可能还高点，你这差值这么小，没人在意的。
我都看糊涂了，磷酸化表达增加是因为磷酸化率增加了啊。在文章里如果你没有想好一个合理的说 ...

呵呵，我是这个意思，某个蛋白不是会有蛋白总量的抗体和磷酸化位点的抗体嘛。我是问有没有可能会蛋白总量的表达下降而用磷酸化位点做出来的表达却是上升趋势（磷酸化位点的表达/总量才是磷酸化或者说是磷酸化率呗，前面我没说清楚吧）。
虽然WB只是个半定量的东西，很多影响因素，但是他的倍数趋势我觉得应该是肯定的，所以不太理解会不会出现蛋白总量减少（倍数小于1），而磷酸化位点的表达却升高（大于1）
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20楼2013-01-30 17:45:08
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