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冼亮淀粉酶专家顾问 (知名作家)
生物大分子降解酶
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“非变性胶电泳测定蛋白质分子量”？慎用！ 已有14人参与
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很久以前就有把自己纯化蛋白质的经验结合实验结果整理成帖发出来，但一直比较懒就没整。算起来，我已经有半年以上时间没有怎么活跃了，原因主要是自己不懂的不能乱说，而自己懂的因为早就说过了所以不想说，而且也有的帖子明明是自己百度一下就能知道也还发，比我还懒。 这个主题帖的产生源于我在一个帖子里的回帖，我想说明一些事情，也很久没有发过主题帖了（虽然我的主题帖也很少），于是就整理一下发了吧。因为我是两个版块的顾问，之前已经在微生物版块发了一个和现在这个帖子内容相关的帖子，所以这个就在生科版发吧。关于里面我的实验结果和观点，如果有人有什么疑问，我建议先不要下定论，先自己动脑思考一下，最好是动手一下，再把实验结果一起分享，到时候就当我的帖子是抛砖引玉了。 首先是非变性胶电泳分离蛋白质的理论基础。我们实验室刚花了8万RMB买了个不中用的通过跑非变性胶电泳将混合蛋白质样品中的目的蛋白质分离的仪器，如图1所示：  图片1.png 大家看说明书的第34页（图2）：  图片2.jpg Native-PAGE Theory的第二段说影响蛋白质在非变性胶中电泳迁移率的因素是分子量和等电点，于是我假设有两个蛋白质的分子量相同，但等电点不同（一个是8.3，另一个是5.5），在电泳缓冲液pH值为8.3时，众所周知，蛋白质在等电点时所带电荷为零，在电场中是不动的（大家想想等电聚焦的原理），等电点8.3的那个蛋白质是连浓缩胶都跑不进去的，根本没有迁移率，更别说迁移率和等电点5.5的那个蛋白质一样了。再作一个更大胆但也仍然符合理论的假设，假如还有第3个蛋白质的等电点为10呢？（3号蛋白质嘉宾遗憾离场，可惜不是你，陪我到最后欧欧欧欧呕。。。。。。。）。 即使它们的分子量和等电点相同，但分子形状一个是球形，另一个是棒状，棒状的蛋白质电泳时被聚丙烯酰胺网络磕磕碰碰，迁移率也是比不上球形的那个蛋白质的（输在了起跑线上，于是到达终点的时候一身伤痕痛哭ing）。 在我的实验中也有一些有趣的现象，我曾经纯化一株AT曲霉的淀粉酶，在经过硫酸铵沉淀、疏水作用柱层析、强阴离子交换柱层析之后获得的蛋白质跑SDS-PAGE发现仍然不够纯，于是只能跑非变性胶电泳割胶了。测定洗脱液收集管中淀粉酶活力之后选定一些收集管跑SDS-PAGE，根据淀粉酶活力在收集管中的分布（图3），  图片3.png 和收集管中各条蛋白质条带随着管号推移，深度和宽度的变化（图4），  图片4.png 推断分子量约为50KD处的一条条带为淀粉酶，将各条明显可辨的条带按照分子量从大到小的顺序编号，淀粉酶的条带为3号。将这些收集管跑非变性胶（图5），  图片5.png 推断出淀粉酶的条带所处位置，但是有趣的事情发生了，以淀粉酶的条带为3号不变，其它条带的迁移率发生了变化！蛋白质跑SDS-PAGE之后确认了分子量，但在非变性胶中迁移率会变化，这就是说在跑非变性胶电泳的时候，影响蛋白质迁移率的除了分子量之外，还有等电点，或许还有分子形状。 我将非变性胶中淀粉酶的条带割下来（详情请看我之前在微生物版块发的帖子：蛋白质纯化——非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后回收蛋白质的简单方法 http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=4054503），得到的样品再次用强阴离子交换柱层析来纯化，样品跑SDS-PAGE之后发现纯度明显提高，但也还是有很多细细的杂带（图6），  图片6.png 我数了一下，分子量18-97KD之间肉眼可分辨的条带大概有20条。也就是说不同分子量的蛋白质在非变性胶电泳中迁移率相同，影响蛋白质迁移率的除了分子量之外，还有等电点，或许还有分子形状。 可见，通过非变性胶来测定蛋白质分子量是存在不确定性的，慎用！如果有人提出不同的看法，我觉得最好是自己能做一些设计严谨、结果可信的实验，再一起讨论。 最常用于测定蛋白质分子量的方法除了在变性条件下的SDS-PAGE，在非变性条件下也可以用凝胶过滤柱层析，这两个方法结合起来可以验证蛋白质是否为多聚体。葡聚糖凝胶（Sephadex）过滤法测定蛋白质分子量的原理， 以下内容来自http://www.biobars.cn/a/jishu/danbaishiyan/20100610/5242.html 主要是依据这种凝胶具有分子筛作用，一定型号的凝胶具有大体上一定大小的孔径。在一定的凝胶柱内，凝胶孔隙所占的体积称为内水容积Vi，凝胶颗粒间的自由空间所占的体积称为外水容积V0。当样品流经凝胶柱时，大于孔隙的大分子完全不?B入到凝胶内部，只需V0体积的洗脱液便可将其由一端洗脱到另一端；相反，如果样品体积小于孔隙，则需要V0＋Vi（即为Ve）体积的洗脱液，才能将它们由一端洗脱到另一端。中等分子（分子大小在上述两种极限之间）所需洗脱液体积介于两者之间，如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，则不同大小分子量的蛋白质，进入凝胶筛孔的程度不同，其洗脱体积决定于分子大小。当蛋白质分子量在10000～15000时，蛋白质在葡聚糖凝胶柱上层析的洗脱体积和分子量的对数呈直线关系。若用已知分子量的标准蛋白质在一定型号葡聚糖凝胶柱上层析，精确测其洗脱体积，并以洗脱体积Ve对分子量的对数logMW作图，可获得一条标准曲线（见图7、8）。未知分子量的蛋白质在相同条件下层析，根据其洗脱体积即可在标准曲线上求得分子量。同样，分子形状最好是接近球形。  图片7.png  图片8.jpg 目前有的文章用非变性胶来测定未知蛋白质的分子量，我认为是不对的，之所以能发表，主要的原因是在整篇文章中，蛋白质分子量根本不是重点数据，而对于编辑来说，瑕疵是可以接受的。所以各位不要看到别人怎么做，自己就照搬，还是得看看具体情况的，不然自己做错了还乐呵呵的以为自己又收获了一项数据，更严重者还根据这个数据设计深入的实验，麻烦就更大了，总之一句话——非变性胶电泳测定蛋白质分子量？慎用！ [ Last edited by 冼亮淀粉酶 on 2013-10-23 at 02:58 ] |
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2013-10-20 04:52:32, 9.16 M
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