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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白质总量，变还是不变！？
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ccharlien

木虫 (正式写手)
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kx444555: 金币+2, 说的很详细 2013-01-31 08:26:24
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10楼: Originally posted by summer2771 at 2013-01-26 00:22:09
我做的信号通路蛋白，如果不盯着磷酸化，光总蛋白说明不了问题啊！
我跑胶的时候，磷酸化和总蛋白不是一版胶跑的，所以各自都有一个内参，但是内参都是齐的，内参效果做的挺好的。
我是做的组织，每一样本组织的 ...

也可以说明问题啊
如果内参不变，而蛋白总量和磷酸化水平都增高，虽然是同向的，也就是说磷酸化的比例不变，但绝对水平上来说翻译和翻译后修饰都是增高的
1.分光光度计测的不一定准，最后还是以western跑出来的内参为标准调整上样
2.总蛋白和磷酸化需要在同一张膜上至少做一次，确认结果之后为了图片更好看可以分两块跑
3.可以多用几种内参确定你的实验结果，也就是说几种内参都一致，而你的总蛋白和磷酸化蛋白水平都上升
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11楼2013-01-26 04:34:42
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summer2771

木虫 (正式写手)
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11楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-26 04:34:42
也可以说明问题啊
如果内参不变，而蛋白总量和磷酸化水平都增高，虽然是同向的，也就是说磷酸化的比例不变，但绝对水平上来说翻译和翻译后修饰都是增高的
1.分光光度计测的不一定准，最后还是以western跑出来的内 ...

哇，你睡这么晚啊！建议你还是早点睡觉吧，当然，在国外的另当别论了。呵呵！

我所看过的论文，总量基本都是不变的，以磷酸化表达的升降来说明该蛋白的活性上调或下调，因为我一般看但的都是信号转导方面的蛋白。不知道你说的这种磷酸化率不变，但从绝对水平上来说翻译和翻译后修饰均增高能不能推荐一两篇文献看下？
我的情况跟你说的这个还不同，我的是磷酸化和总量都上升，但是如果用磷酸化/总量的磷酸化率话却是表现为下降，而不是比例不变。这个我就有点不明白，该以哪个为准，该如何解释...
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12楼2013-01-26 12:53:08
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summer2771

木虫 (正式写手)
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11楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-26 04:34:42
也可以说明问题啊
如果内参不变，而蛋白总量和磷酸化水平都增高，虽然是同向的，也就是说磷酸化的比例不变，但绝对水平上来说翻译和翻译后修饰都是增高的
1.分光光度计测的不一定准，最后还是以western跑出来的内 ...

另外请教一下，是否会出现这种情况：蛋白总量呈下降趋势，比如与对照组相比倍数为0.93、0.95倍，但是磷酸化表达却是升高的比如1.1或1.2倍
这样的话，用磷酸化/总量，出来的倍数则会大于磷酸化/内参所表现出的1.1或1.2倍，比如达到1.4或1.5倍。我简单列个表在下面以方便你看：
相对倍数 对照 处理组1  处理组2
总量        1        0.93      0.95
磷酸化    1        1.20      1.10
磷/总     1        1.40       1.50
总量均值为0.93、95，一个one way anova比较均值，是无显著性差异的，所以就是所说的总量不变。但是从趋势上看，处理组的总量是下降的。但磷酸化表达都是升高的！势必最后的磷酸化/总量会升的更高。
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13楼2013-01-26 12:59:56
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ccharlien

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13楼: Originally posted by summer2771 at 2013-01-26 12:59:56
另外请教一下，是否会出现这种情况：蛋白总量呈下降趋势，比如与对照组相比倍数为0.93、0.95倍，但是磷酸化表达却是升高的比如1.1或1.2倍
这样的话，用磷酸化/总量，出来的倍数则会大于磷酸化/内参所表现出的1.1或 ...

Western本身只能半定量，没有那么准的，误差不小，用来取灰度值的照片要曝光的尽量浅才能看出差异
这些数值差异都太小，磷/总应该是 1 1.29 1.16吧
要我看就是处理组总量不变磷酸化上升，我会再进行一次实验验证
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14楼2013-01-26 17:16:01
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summer2771

木虫 (正式写手)
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14楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-26 17:16:01
Western本身只能半定量，没有那么准的，误差不小，用来取灰度值的照片要曝光的尽量浅才能看出差异
这些数值差异都太小，磷/总应该是 1 1.29 1.16吧
要我看就是处理组总量不变磷酸化上升，我会再进行一次实验验证...

我的意思就是想问问，是不是会出现总蛋白量略减少，比如上面例子中的0.95、0.93，但是磷酸化表达却增加，为1.1或1.2的情况呢？
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15楼2013-01-26 22:44:01
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wcj668899

至尊木虫 (文坛精英)

教师
很好！！谢谢！！
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抓紧努力，狠抓重点，省时高效，再创辉煌。
16楼2013-01-27 01:08:58
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ccharlien

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15楼: Originally posted by summer2771 at 2013-01-26 22:44:01
我的意思就是想问问，是不是会出现总蛋白量略减少，比如上面例子中的0.95、0.93，但是磷酸化表达却增加，为1.1或1.2的情况呢？...

这不是你想要的结果么？
而且0.95 0.93没有统计学意义，也不能说蛋白量减少吧
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17楼2013-01-27 04:28:40
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summer2771

木虫 (正式写手)
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17楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-27 04:28:40
这不是你想要的结果么？
而且0.95 0.93没有统计学意义，也不能说蛋白量减少吧...

我的一组中有好几个都是这样的，最后求均值加标准差，均值就是0.95、0.93左右，虽然没有统计学意义，但是趋势是蛋白总量减少的。但是他们的磷酸化表达均值都是升高的，我不知道会不会有这一种情况出现，在我看来，实验组与对照组相比，磷酸化表达的均值是升高的，那总量的趋势也就一定是升高的。
我觉得人家会质疑我出现的这种情况：难道总量趋势是减少的，磷酸化表达的趋势会是增加的！？
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18楼2013-01-27 19:44:08
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ccharlien

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18楼: Originally posted by summer2771 at 2013-01-27 19:44:08
我的一组中有好几个都是这样的，最后求均值加标准差，均值就是0.95、0.93左右，虽然没有统计学意义，但是趋势是蛋白总量减少的。但是他们的磷酸化表达均值都是升高的，我不知道会不会有这一种情况出现，在我看来， ...

哈哈，我想人家不会质疑这个吧，毕竟western只是半定量方法，差个20%可信度可能还高点，你这差值这么小，没人在意的。
我都看糊涂了，磷酸化表达增加是因为磷酸化率增加了啊。在文章里如果你没有想好一个合理的说法就说总蛋白没改变就行了，反正图在那放着哪
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19楼2013-01-30 14:25:42
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summer2771

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19楼: Originally posted by ccharlien at 2013-01-30 14:25:42
哈哈，我想人家不会质疑这个吧，毕竟western只是半定量方法，差个20%可信度可能还高点，你这差值这么小，没人在意的。
我都看糊涂了，磷酸化表达增加是因为磷酸化率增加了啊。在文章里如果你没有想好一个合理的说 ...

呵呵，我是这个意思，某个蛋白不是会有蛋白总量的抗体和磷酸化位点的抗体嘛。我是问有没有可能会蛋白总量的表达下降而用磷酸化位点做出来的表达却是上升趋势（磷酸化位点的表达/总量才是磷酸化或者说是磷酸化率呗，前面我没说清楚吧）。
虽然WB只是个半定量的东西，很多影响因素，但是他的倍数趋势我觉得应该是肯定的，所以不太理解会不会出现蛋白总量减少（倍数小于1），而磷酸化位点的表达却升高（大于1）
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20楼2013-01-30 17:45:08
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