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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 反转录PCR扩增后条带问题
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天yi

铜虫 (小有名气)

[求助] 反转录PCR扩增后条带问题

最近在做反转录PCR，事先通过Primer5.0确定了引物位置，扩增出的目的条带应该有1500bp，不知道为什么我做出来的只有500bp左右，求高人指点啊？我是新手，这方面不怎么懂.
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1楼 2012-10-18 20:43:24
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
会不会是没考虑内含子？如果是根据基因组DNA设计的引物，而碰巧这1500bp里面有内含子，就可能出现这种情况。因为从RNA反转录来的cDNA是不包括内含子的。
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2楼2012-10-18 20:54:11
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天yi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-10-18 20:54:11
会不会是没考虑内含子？如果是根据基因组DNA设计的引物，而碰巧这1500bp里面有内含子，就可能出现这种情况。因为从RNA反转录来的cDNA是不包括内含子的。

PCR扩增目的条带有2300bp，内含子大约只有800bp，就是去掉内含子之后应该是1500bp
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3楼2012-10-19 14:23:59
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guoxingliu

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
天yi: 金币+1 2012-10-22 21:28:57
设计的引物特异性好吗，否则可能反转录的是整个cDNA的部分序列，建议在检查检查！
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4楼2012-10-21 09:21:31
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天yi

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by guoxingliu at 2012-10-21 09:21:31
设计的引物特异性好吗，否则可能反转录的是整个cDNA的部分序列，建议在检查检查！

那是不是去测序一下？
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5楼2012-10-22 21:30:00
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guoxingliu

木虫 (小有名气)
到ncbi比对一下，看是否有同源的刚好是500bp。
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6楼2012-10-23 17:31:07
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gdj363702043

金虫 (正式写手)
我觉得大部分发生这种情况一般都是引物问题就是发生非特异性扩增   前提是你测试过你RNA提取的纯度达标情况下
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加油努力
7楼2012-11-21 09:43:13
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