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yqs129219

新虫 (小有名气)

[求助] 请问各位前辈们，这样的RNA电泳图能用于RT-PCR吗？

上样量是5ul的RNA和1ul的6Xloding Buffer  前面是DNA Marker2000，颜色淡的浓度是不是很低啊

4列为一个样



4列为一个样
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1楼 2012-07-09 17:48:49
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shenye.judy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, 鼓励发帖帮助解答问题。 2012-07-09 21:03:10
跑RNA时，还是先测量下OD值，然后加入等量的RNA（0.5-0.75ug），而不是加入等体积的，可比性不好。根据现在的图，看RNA完整度的话，还可以，勉强能用RT-PCR。当然如果做基因表达量比较的话，尽量用质量好的，一致的ＲＮＡ。
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2楼2012-07-09 19:46:29
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yqs129219

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by shenye.judy at 2012-07-09 19:46:29
跑RNA时，还是先测量下OD值，然后加入等量的RNA（0.5-0.75ug），而不是加入等体积的，可比性不好。根据现在的图，看RNA完整度的话，还可以，勉强能用RT-PCR。当然如果做基因表达量比较的话，尽量用质量好的，一致的 ...

测OD值也不一定准确的，根据Marker亮度来大致估算RNA浓度。这样可以吧。我是反转录用来做同源克隆的
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3楼2012-07-09 20:44:15
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shenye.judy

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-07-10 13:45:50
反转录用来做同源克隆，那就没那么严格了，你可以直接往下做试试。
另外，如果你提取的质量较好，且质量较一致的话，跑出来的条带亮度基本是一致的（等量的RNA）。
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4楼2012-07-10 10:40:55
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豆豆5273

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-11 13:48:36
我觉得你是上样前未用枪头搅均匀吧，不然，同样的RNA应该是条带亮度一致的啊。。。从亮度来看，可以做反转，分成3管，1管 随机引物，1管特异性引物，1管oligo dT..后面做PCR的引物一定 要好好设计，最好找有经验的人，不同软件分析 后评价都好，再订引物。 一次PCR后上样 如果没条带或者条带浅，就 二次PCR
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选择生物并为之努力
5楼2012-07-10 20:32:56
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yqs129219

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 豆豆5273 at 2012-07-10 20:32:56
我觉得你是上样前未用枪头搅均匀吧，不然，同样的RNA应该是条带亮度一致的啊。。。从亮度来看，可以做反转，分成3管，1管 随机引物，1管特异性引物，1管oligo dT..后面做PCR的引物一定 要好好设计，最好找有经验的人 ...

一个样出来的4管，不是4列都是一个EP管里的，一个管里的亮度肯定会一样啦
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6楼2012-07-11 10:08:17
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yqs129219

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 豆豆5273 at 2012-07-10 20:32:56
我觉得你是上样前未用枪头搅均匀吧，不然，同样的RNA应该是条带亮度一致的啊。。。从亮度来看，可以做反转，分成3管，1管 随机引物，1管特异性引物，1管oligo dT..后面做PCR的引物一定 要好好设计，最好找有经验的人 ...

二次PCR，重复第一次的么
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7楼2012-07-11 10:56:27
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你上样是不是戳到胶孔了？还是本身有基因组污染？如果不是操作问题的话，我建议你加DNase I消化一下再上样电泳
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8楼2012-07-12 08:40:43
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longrna

新虫 (正式写手)
不知道有没有测OD，参考一下OF260/280。点样孔亮可能有杂质（如蛋白）。抽提不干净或转移上清时吸到中间层的蛋白了。下次注意。
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伟大航线....
9楼2012-07-12 08:57:45
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feixiang1209

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
挺好的了，反转录前测下浓度保证反转录时的RNA量一致就可以了
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10楼2012-07-12 08:58:11
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