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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » ＲＴ－ＰＣＲ问题求助
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wkl1984

金虫 (小有名气)

[求助] ＲＴ－ＰＣＲ问题求助

做反转录，按照生工的AMV一步反转录试剂盒的具体内容操作，但是试剂盒不建议用随机六聚体引物扩增，我正好用随机六聚体引物扩增了，扩增的结果如下，1为1000kb的marker，2 为ＲＴ－ＰＣＲ产物，marker好像有问题。扩增条件为  预变性45° 30min,PCR扩增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40个循环，终延伸为72°1min。另外，模板ＤＮＡ的量加了3微升，总模板DNA小余1微克。其余按照试剂盒操作。特异性差一点，请大家给出建议
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1楼2011-04-30 22:51:03
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新人小玥

木虫 (正式写手)
请问楼主的具体问题是什么？
您的表述不太明确呀
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2楼2011-05-01 09:04:15
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wkl1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 新人小玥 at 2011-05-01 09:04:15:
请问楼主的具体问题是什么？
您的表述不太明确呀

就是如何提高特异性，主要是扩增的条带不亮，如何让提高特异性？
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3楼2011-05-01 09:09:51
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+2): 2011-05-01 10:47:00
特异性提高呀
1、提高退火温度。不过我觉得你的退火温度已经挺高的了，可以试试两步法。
2、换其它酶试试。
3、再不行就需要重新设计引物了。
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4楼2011-05-01 09:44:33
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wkl1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 新人小玥 at 2011-05-01 09:44:33:
特异性提高呀
1、提高退火温度。不过我觉得你的退火温度已经挺高的了，可以试试两步法。
2、换其它酶试试。
3、再不行就需要重新设计引物了。

不过我看试剂盒的说明上说可能的原因是反应条件不合适或者是使用的引物问题，我现在不知道主要问题出在那里了，希望给予指点
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5楼2011-05-01 10:46:42
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): 鼓励交流，很热心。 2011-05-02 00:24:10
wkl1984(金币+2): 2011-05-02 11:20:04
引用回帖:
Originally posted by wkl1984 at 2011-05-01 10:46:42:
不过我看试剂盒的说明上说可能的原因是反应条件不合适或者是使用的引物问题，我现在不知道主要问题出在那里了，希望给予指点

反应条件就是指PCR过程中的PCR体系和PCR反应程序。
引物就是设计引物时是否符合引物特异性标准和是否有可能引入引物二聚体。这就需要你查看一下引物序列。
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6楼2011-05-01 20:35:01
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wkl1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 新人小玥 at 2011-05-01 20:35:01:
反应条件就是指PCR过程中的PCR体系和PCR反应程序。
引物就是设计引物时是否符合引物特异性标准和是否有可能引入引物二聚体。这就需要你查看一下引物序列。

不过我调了镁离子的浓度可以扩增出条带
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7楼2011-05-02 16:31:56
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励应助 2011-05-03 00:34:13
wkl1984(金币+3): 2011-05-04 09:51:03
引用回帖:
Originally posted by wkl1984 at 2011-05-02 16:31:56:
不过我调了镁离子的浓度可以扩增出条带

你原来不就可以扩增出条带吗？
你可以把你详细的实验过程告诉我，我帮你分析分析。
例如引物序列，预测获得PCR产物序列、反应体系，程序等等
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8楼2011-05-02 20:59:06
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yangqq8282

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 鼓励新朋友交流 2011-05-03 10:41:51
wkl1984(金币+1): 2011-05-03 13:23:30
wkl1984(金币+12): 2011-05-04 09:51:11
最关键的是引物的设计问题
其次可以提高退火温度，或使用梯度降温
第三要提高核酸电泳技术
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9楼2011-05-03 10:28:59
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wkl1984

金虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-05-06 08:45:06
引用回帖:
Originally posted by 新人小玥 at 2011-05-02 20:59:06:
你原来不就可以扩增出条带吗？
你可以把你详细的实验过程告诉我，我帮你分析分析。
例如引物序列，预测获得PCR产物序列、反应体系，程序等等

扩增条件为  预变性45° 30min,PCR扩增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40个循环，终延伸为72°1min。反应体系为ddH2o 19微升，2×RT-PCR Buffer 25微升，AMV Rt/taq Mix 1微升，随机六聚体引物 2微升，模板DNA 3微升，总体积 50微升。引物为随机六聚体引物，购买于Takara，配置浓度为0.2微摩尔每升。预测得到的PCR的序列长度为400-500bp，具体的序列我没有找到，只是按照构建svFv的操作手册和参考文献进行，可是为什么文献上都不给出CDNA的结果？仅给出了通过cDNA扩增出VH和VL的片段，其中VH和VL的片段大约为350bp,VH的片段为397bp,VL的片段为330bp.并且资料提供说按照cDNA合成试剂盒操作。
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10楼2011-05-04 10:06:25
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