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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » ＲＴ－ＰＣＲ问题求助
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wkl1984

金虫 (小有名气)

[求助] ＲＴ－ＰＣＲ问题求助

做反转录，按照生工的AMV一步反转录试剂盒的具体内容操作，但是试剂盒不建议用随机六聚体引物扩增，我正好用随机六聚体引物扩增了，扩增的结果如下，1为1000kb的marker，2 为ＲＴ－ＰＣＲ产物，marker好像有问题。扩增条件为  预变性45° 30min,PCR扩增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40个循环，终延伸为72°1min。另外，模板ＤＮＡ的量加了3微升，总模板DNA小余1微克。其余按照试剂盒操作。特异性差一点，请大家给出建议
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1楼 2011-04-30 22:51:03
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yangqq8282

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 鼓励新朋友交流 2011-05-03 10:41:51
wkl1984(金币+1): 2011-05-03 13:23:30
wkl1984(金币+12): 2011-05-04 09:51:11
最关键的是引物的设计问题
其次可以提高退火温度，或使用梯度降温
第三要提高核酸电泳技术
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9楼2011-05-03 10:28:59
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新人小玥

木虫 (正式写手)
请问楼主的具体问题是什么？
您的表述不太明确呀
赞一下 回复此楼
2楼2011-05-01 09:04:15
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wkl1984

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 新人小玥 at 2011-05-01 09:04:15:
请问楼主的具体问题是什么？
您的表述不太明确呀

就是如何提高特异性，主要是扩增的条带不亮，如何让提高特异性？
赞一下 回复此楼
3楼2011-05-01 09:09:51
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+2): 2011-05-01 10:47:00
特异性提高呀
1、提高退火温度。不过我觉得你的退火温度已经挺高的了，可以试试两步法。
2、换其它酶试试。
3、再不行就需要重新设计引物了。
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4楼2011-05-01 09:44:33
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