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wkl1984金虫 (小有名气)
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ＲＴ－ＰＣＲ问题求助
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做反转录，按照生工的AMV一步反转录试剂盒的具体内容操作，但是试剂盒不建议用随机六聚体引物扩增，我正好用随机六聚体引物扩增了，扩增的结果如下，1为1000kb的marker，2 为ＲＴ－ＰＣＲ产物，marker好像有问题。扩增条件为 预变性45° 30min,PCR扩增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40个循环，终延伸为72°1min。另外，模板ＤＮＡ的量加了3微升，总模板DNA小余1微克。其余按照试剂盒操作。特异性差一点，请大家给出建议 |
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wkl1984
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3楼2011-05-01 09:09:51
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7楼2011-05-02 16:31:56
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dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-05-06 08:45:06
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-05-06 08:45:06
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扩增条件为 预变性45° 30min,PCR扩增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40个循环，终延伸为72°1min。反应体系为ddH2o 19微升，2×RT-PCR Buffer 25微升，AMV Rt/taq Mix 1微升，随机六聚体引物 2微升，模板DNA 3微升，总体积 50微升。引物为随机六聚体引物，购买于Takara，配置浓度为0.2微摩尔每升。预测得到的PCR的序列长度为400-500bp，具体的序列我没有找到，只是按照构建svFv的操作手册和参考文献进行，可是为什么文献上都不给出CDNA的结果？仅给出了通过cDNA扩增出VH和VL的片段，其中VH和VL的片段大约为350bp,VH的片段为397bp,VL的片段为330bp.并且资料提供说按照cDNA合成试剂盒操作。 |
10楼2011-05-04 10:06:25
wkl1984
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15楼2011-05-06 09:44:00
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18楼2011-05-06 15:18:32