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wkl1984

金虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR问题求助

做反转录,按照生工的AMV一步反转录试剂盒的具体内容操作,但是试剂盒不建议用随机六聚体引物扩增,我正好用随机六聚体引物扩增了,扩增的结果如下,1为1000kb的marker,2 为RT-PCR产物,marker好像有问题。扩增条件为  预变性45° 30min,PCR扩增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40个循环,终延伸为72°1min。另外,模板DNA的量加了3微升,总模板DNA小余1微克。其余按照试剂盒操作。特异性差一点,请大家给出建议
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wkl1984

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 新人小玥 at 2011-05-05 21:40:27:
为什么用随机六碱基为引物?RT-PCR不是应该使用特异性引物吗?随机六碱基只有在反转录的时候才用到呀。

是啊,我用的是一步反转录,只是扩增时没有得到大约在400-500bp的序列
15楼2011-05-06 09:44:00
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新人小玥

木虫 (正式写手)

请问楼主的具体问题是什么?
您的表述不太明确呀
2楼2011-05-01 09:04:15
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wkl1984

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 新人小玥 at 2011-05-01 09:04:15:
请问楼主的具体问题是什么?
您的表述不太明确呀

就是如何提高特异性,主要是扩增的条带不亮,如何让提高特异性?
3楼2011-05-01 09:09:51
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+2): 2011-05-01 10:47:00
特异性提高呀
1、提高退火温度。不过我觉得你的退火温度已经挺高的了,可以试试两步法。
2、换其它酶试试。
3、再不行就需要重新设计引物了。
4楼2011-05-01 09:44:33
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