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wkl1984

金虫 (小有名气)

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[求助] ＲＴ－ＰＣＲ问题求助

做反转录，按照生工的AMV一步反转录试剂盒的具体内容操作，但是试剂盒不建议用随机六聚体引物扩增，我正好用随机六聚体引物扩增了，扩增的结果如下，1为1000kb的marker，2 为ＲＴ－ＰＣＲ产物，marker好像有问题。扩增条件为预变性45° 30min,PCR扩增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40个循环，终延伸为72°1min。另外，模板ＤＮＡ的量加了3微升，总模板DNA小余1微克。其余按照试剂盒操作。特异性差一点，请大家给出建议

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1楼2011-04-30 22:51:03

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wkl1984

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dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-05-06 08:45:06

引用回帖:

Originally posted by 新人小玥 at 2011-05-02 20:59:06:
你原来不就可以扩增出条带吗？
你可以把你详细的实验过程告诉我，我帮你分析分析。
例如引物序列，预测获得PCR产物序列、反应体系，程序等等

扩增条件为预变性45° 30min,PCR扩增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40个循环，终延伸为72°1min。反应体系为ddH2o 19微升，2×RT-PCR Buffer 25微升，AMV Rt/taq Mix 1微升，随机六聚体引物 2微升，模板DNA 3微升，总体积 50微升。引物为随机六聚体引物，购买于Takara，配置浓度为0.2微摩尔每升。预测得到的PCR的序列长度为400-500bp，具体的序列我没有找到，只是按照构建svFv的操作手册和参考文献进行，可是为什么文献上都不给出CDNA的结果？仅给出了通过cDNA扩增出VH和VL的片段，其中VH和VL的片段大约为350bp,VH的片段为397bp,VL的片段为330bp.并且资料提供说按照cDNA合成试剂盒操作。