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wkl1984

金虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR问题求助

做反转录,按照生工的AMV一步反转录试剂盒的具体内容操作,但是试剂盒不建议用随机六聚体引物扩增,我正好用随机六聚体引物扩增了,扩增的结果如下,1为1000kb的marker,2 为RT-PCR产物,marker好像有问题。扩增条件为  预变性45° 30min,PCR扩增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40个循环,终延伸为72°1min。另外,模板DNA的量加了3微升,总模板DNA小余1微克。其余按照试剂盒操作。特异性差一点,请大家给出建议
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wkl1984

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 新人小玥 at 2011-05-01 20:35:01:
反应条件就是指PCR过程中的PCR体系和PCR反应程序。
引物就是设计引物时是否符合引物特异性标准和是否有可能引入引物二聚体。这就需要你查看一下引物序列。

不过我调了镁离子的浓度可以扩增出条带
7楼2011-05-02 16:31:56
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新人小玥

木虫 (正式写手)

请问楼主的具体问题是什么?
您的表述不太明确呀
2楼2011-05-01 09:04:15
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wkl1984

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 新人小玥 at 2011-05-01 09:04:15:
请问楼主的具体问题是什么?
您的表述不太明确呀

就是如何提高特异性,主要是扩增的条带不亮,如何让提高特异性?
3楼2011-05-01 09:09:51
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

wkl1984(金币+2): 2011-05-01 10:47:00
特异性提高呀
1、提高退火温度。不过我觉得你的退火温度已经挺高的了,可以试试两步法。
2、换其它酶试试。
3、再不行就需要重新设计引物了。
4楼2011-05-01 09:44:33
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