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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by wkl1984 at 2011-05-04 10:06:25:
扩增条件为  预变性45° 30min,PCR扩增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40个循环,终延伸为72°1min。反应体系为ddH2o 19微升,2×RT-PCR Buffer 25微升,AMV Rt/taq Mix 1微升,随机六聚体引物 2微升,模板DNA  ...

为什么用随机六碱基为引物?RT-PCR不是应该使用特异性引物吗?随机六碱基只有在反转录的时候才用到呀。
11楼2011-05-05 21:40:27
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by wkl1984 at 2011-05-04 10:06:25:
扩增条件为  预变性45° 30min,PCR扩增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40个循环,终延伸为72°1min。反应体系为ddH2o 19微升,2×RT-PCR Buffer 25微升,AMV Rt/taq Mix 1微升,随机六聚体引物 2微升,模板DNA  ...

我是没用过一步法的试剂盒,但是,你的体系里没有基因特异的引物啊,怎么能扩增出特定的基因呢?
12楼2011-05-05 22:01:06
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-05-06 08:45:24
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Originally posted by 新人小玥 at 2011-05-05 21:40:27:
为什么用随机六碱基为引物?RT-PCR不是应该使用特异性引物吗?随机六碱基只有在反转录的时候才用到呀。

楼主用的是一步法,即反转录和PCR两个反应都在同一个管子里完成。但是他这里没有加特异引物呢……
13楼2011-05-05 22:02:13
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vinatone

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 热心鼓励 2011-05-06 08:45:37
用touchdownPCR试试,不行就换引物
14楼2011-05-05 23:54:00
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wkl1984

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 新人小玥 at 2011-05-05 21:40:27:
为什么用随机六碱基为引物?RT-PCR不是应该使用特异性引物吗?随机六碱基只有在反转录的时候才用到呀。

是啊,我用的是一步反转录,只是扩增时没有得到大约在400-500bp的序列
15楼2011-05-06 09:44:00
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by 西瓜 at 2011-05-05 22:02:13:
楼主用的是一步法,即反转录和PCR两个反应都在同一个管子里完成。但是他这里没有加特异引物呢……

我就是奇怪这件事。
16楼2011-05-06 13:18:03
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by wkl1984 at 2011-05-06 09:44:00:
是啊,我用的是一步反转录,只是扩增时没有得到大约在400-500bp的序列

没有特异引物,怎么会扩出来呢?
我没有用过一步法,但是想想都不会有特异条带出来呀。
17楼2011-05-06 13:19:48
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wkl1984

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 新人小玥 at 2011-05-06 13:19:48:
没有特异引物,怎么会扩出来呢?
我没有用过一步法,但是想想都不会有特异条带出来呀。

我对这个的理解不是很透彻,但是文献上涌随机六聚体引物,九聚体引物和Olig dT等引物扩增,那么扩增的条带有很多,然后再经过第二次PCR扩增,筛选出了具体想要的片段,主要见于构建cDNA文库,抗体文库等。
18楼2011-05-06 15:18:32
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新人小玥

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by wkl1984 at 2011-05-06 15:18:32:
我对这个的理解不是很透彻,但是文献上涌随机六聚体引物,九聚体引物和Olig dT等引物扩增,那么扩增的条带有很多,然后再经过第二次PCR扩增,筛选出了具体想要的片段,主要见于构建cDNA文库,抗体文库等。

加入随机六碱基等是用于反转录的吧,你要PCR出特异基因的话是要求加入特异引物才能得到的呀。

构建cDNA文库的时候是一个大库,什么基因都有,所以不需要特殊引物。你要看自己是实验目的了。不过这样PCR的得到的就不是一条带,而是一片弥散的条带。

不知道你的实验原来是怎么设计的,可以好好考虑考虑。
19楼2011-05-08 09:38:16
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