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wkl1984

金虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR问题求助

做反转录,按照生工的AMV一步反转录试剂盒的具体内容操作,但是试剂盒不建议用随机六聚体引物扩增,我正好用随机六聚体引物扩增了,扩增的结果如下,1为1000kb的marker,2 为RT-PCR产物,marker好像有问题。扩增条件为  预变性45° 30min,PCR扩增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40个循环,终延伸为72°1min。另外,模板DNA的量加了3微升,总模板DNA小余1微克。其余按照试剂盒操作。特异性差一点,请大家给出建议
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
Originally posted by wkl1984 at 2011-05-04 10:06:25:
扩增条件为  预变性45° 30min,PCR扩增94° 15s ,60° 30s,72° 1min,40个循环,终延伸为72°1min。反应体系为ddH2o 19微升,2×RT-PCR Buffer 25微升,AMV Rt/taq Mix 1微升,随机六聚体引物 2微升,模板DNA  ...

我是没用过一步法的试剂盒,但是,你的体系里没有基因特异的引物啊,怎么能扩增出特定的基因呢?
12楼2011-05-05 22:01:06
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-05-06 08:45:24
引用回帖:
Originally posted by 新人小玥 at 2011-05-05 21:40:27:
为什么用随机六碱基为引物?RT-PCR不是应该使用特异性引物吗?随机六碱基只有在反转录的时候才用到呀。

楼主用的是一步法,即反转录和PCR两个反应都在同一个管子里完成。但是他这里没有加特异引物呢……
13楼2011-05-05 22:02:13
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