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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】连接转化
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475502411

铜虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】连接转化已有8人参与

我最近做原核表达，但是目的片段和质粒都双酶切后连接不成功，不知道是什么问题，请各位赐教！
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1楼2011-04-12 22:06:01
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
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西瓜(金币+2, EPI+1): 分析得很全面了，赞！ 2011-04-12 23:53:46
1：质粒酶切的是否彻底，还有基因呢？如果酶切的不够彻底的话，肯定影响连接效率了；
2：你连接体系的设计，如果基因和质粒的量不合适，也会影响连接效率滴；
3：连接时间呢？
4：筛选过程，你可以先进行PCR验证，然后提取质粒酶切进行验证。

总之这个连接转化是分子生物学最基础的技术了，一定得扎实了，这样对于后期实验有很大帮助。
祝好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-04-12 22:23:16
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
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西瓜(金币+3): 个人也觉得双酶切出问题可能性比较大 2011-04-12 23:54:35
引用回帖:
Originally posted by 475502411 at 2011-04-12 22:06:01:
我最近做原核表达，但是目的片段和质粒都双酶切后连接不成功，不知道是什么问题，请各位赐教！

双酶切有问题~

见帖子http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3062980
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
3楼2011-04-12 22:23:44
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)
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西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-04-14 11:53:44
1.酶连16℃过夜
2.酶连体系10ul比较好，常规是小体积酶连，大体积酶切
3.双酶切可以分两步单酶切完成，第一次用便宜的酶切后回收在切第二个
4.酶连体系的目的片段和质粒摩尔比要控制好（1:3~1:10），有条件的话核酸定量仪测定要浓度，也可以做几个梯度比例
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4楼2011-04-13 12:23:35
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
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西瓜(金币+3): 感谢分享 2011-04-14 11:54:42
引用回帖:
Originally posted by 475502411 at 2011-04-12 22:06:01:
我最近做原核表达，但是目的片段和质粒都双酶切后连接不成功，不知道是什么问题，请各位赐教！

1.片段和载体的质量是首先要保证的。片段注意尽量不要有其他条带的污染，尤其是小条带（小条带的连接效率是远远大于大条带的）
2.关于酶切：限制性内切酶对 线性DNA的切割效率要稍低于环状的质粒，因此要适当延长PCR片段的酶切时间；还有PCR产物两端的酶切位点前有没有加足够的保护碱基，裸露的酶切位点是无法酶切的；在进行双酶切时，载体上如果两个酶切位点离得比较近(即切完后无法通过跑胶看到切下的小片段)建议不要进行一步双酶切，而是要分步酶切，这样比较保险；酶切完后PCR片段可以直接过柱回收，质粒最好割胶回收。
3.关于连接：只要控制好片段载体的比例，抗性弄不错的话按操作规程来是不会出现什么问题的
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yu棒棒
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
5楼2011-04-13 13:31:39
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csdyg

木虫 (正式写手)
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西瓜(金币+3): 感谢分享经验 2011-04-14 11:54:29
双酶切连接转化做了好多了，有几点小小经验也分享一下。
1. 双酶切酶的选择，如果只能选固定的酶，那根据公司推荐选择合适的双酶切buffer，如果没有合适buffer，可进行分步酶切。酶切体系一般在30-100ul为宜。如果使用的酶没有星号活性的情况下，适当增加酶切时间。
2. 个人感觉在酶切回收过程中需要注意的地方是胶回收，酶切后应尽量避免胶回收，避免紫外照射，我做的时候一般是克隆质粒上或者PCR产物后的插入片段进行胶回收，表达载体酶切后直接沉降，因为载体一般较大，充分酶切打开后，短时间内沉降小片段不容易回收，而载体一般都可以回收得到，同时洗的时候又可以把小片段洗除。
3. 掌握好插入片段和载体的配比，有公式可以计算，载体浓度低一点问题不大。

也可以说一下你的详细步骤，大家再讨论
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6楼2011-04-14 03:13:55
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conanlp

银虫 (初入文坛)
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ls都是牛人~~~受教了，在连一个2.7K的，试了好几次都不成功，纠结中
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7楼2011-04-14 11:04:22
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alice

铁杆木虫 (正式写手)
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顶一下，最近做的好纠结~
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To be strong enough
8楼2011-12-03 16:13:29
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yu棒棒

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
682241楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-13 13:31:39
1.片段和载体的质量是首先要保证的。片段注意尽量不要有其他条带的污染，尤其是小条带（小条带的连接效率是远远大于大条带的）
2.关于酶切：限制性内切酶对 线性DNA的切割效率要稍低于环状的质粒，因此要适当延长 ...

老师，您好！ 我现在一般是用ECOR 1 和NOT 1对表达载体pPIC9K、pPIC3.5K进行双酶切，酶切后跑胶的确不能看到切下的小片段，您说建议进行分步酶切，那分步酶切的条件一般怎么，每一步酶切大概需要多久，酶切后我需要跑胶，然后切胶回收吗？
     初次接触双酶切，有很多问题，希望能得到老师的回复，谢谢！
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9楼2012-06-18 21:26:20
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yu棒棒

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
713222楼: Originally posted by csdyg at 2011-04-14 03:13:55
双酶切连接转化做了好多了，有几点小小经验也分享一下。
1. 双酶切酶的选择，如果只能选固定的酶，那根据公司推荐选择合适的双酶切buffer，如果没有合适buffer，可进行分步酶切。酶切体系一般在30-100ul为宜。如果 ...

老师，您好！ 看了您的经验，我对第二条不是很明白，您的意思是表达载体酶切后不要回收么？可是您后来解释说载体一般可以回收得到，是什么意思？
今天我第一次做双酶切，酶切后跑胶，看到酶切效果不错，然后我做了胶回收，可是克隆质粒上切下的插入片段回收到了，表达载体的却没有回收到。老师，我不应该将表达载体做胶回收么？
初次接触这一块，有很多问题，想恳请老师批评指正。谢谢！
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10楼2012-06-18 21:33:10
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