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【求助/交流】连接转化已有8人参与
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| 我最近做原核表达，但是目的片段和质粒都双酶切后连接不成功，不知道是什么问题，请各位赐教！ |
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csdyg
木虫 (正式写手)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+3): 感谢分享经验 2011-04-14 11:54:29
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+3): 感谢分享经验 2011-04-14 11:54:29
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双酶切连接转化做了好多了，有几点小小经验也分享一下。 1. 双酶切酶的选择，如果只能选固定的酶，那根据公司推荐选择合适的双酶切buffer，如果没有合适buffer，可进行分步酶切。酶切体系一般在30-100ul为宜。如果使用的酶没有星号活性的情况下，适当增加酶切时间。 2. 个人感觉在酶切回收过程中需要注意的地方是胶回收，酶切后应尽量避免胶回收，避免紫外照射，我做的时候一般是克隆质粒上或者PCR产物后的插入片段进行胶回收，表达载体酶切后直接沉降，因为载体一般较大，充分酶切打开后，短时间内沉降小片段不容易回收，而载体一般都可以回收得到，同时洗的时候又可以把小片段洗除。 3. 掌握好插入片段和载体的配比，有公式可以计算，载体浓度低一点问题不大。 也可以说一下你的详细步骤，大家再讨论 |
6楼2011-04-14 03:13:55