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铜虫 (著名写手)

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[交流] 【求助/交流】连接转化已有8人参与

我最近做原核表达，但是目的片段和质粒都双酶切后连接不成功，不知道是什么问题，请各位赐教！

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可以朝九晚五，也能浪迹天涯

1楼 2011-04-12 22:06:01

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

csdyg

木虫 (正式写手)

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★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+3): 感谢分享经验 2011-04-14 11:54:29

双酶切连接转化做了好多了，有几点小小经验也分享一下。
1. 双酶切酶的选择，如果只能选固定的酶，那根据公司推荐选择合适的双酶切buffer，如果没有合适buffer，可进行分步酶切。酶切体系一般在30-100ul为宜。如果使用的酶没有星号活性的情况下，适当增加酶切时间。
2. 个人感觉在酶切回收过程中需要注意的地方是胶回收，酶切后应尽量避免胶回收，避免紫外照射，我做的时候一般是克隆质粒上或者PCR产物后的插入片段进行胶回收，表达载体酶切后直接沉降，因为载体一般较大，充分酶切打开后，短时间内沉降小片段不容易回收，而载体一般都可以回收得到，同时洗的时候又可以把小片段洗除。
3. 掌握好插入片段和载体的配比，有公式可以计算，载体浓度低一点问题不大。

也可以说一下你的详细步骤，大家再讨论

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