24小时热门版块排行榜

返回列表

本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

475502411

铜虫 (著名写手)

MolEPI: 2
应助: 24 (小学生)
金币: 251.2
散金: 1492
红花: 17
帖子: 1037
在线: 203.2小时
虫号: 933070
注册: 2009-12-25
性别: MM
专业: 认知心理学

[交流] 【求助/交流】连接转化已有8人参与

我最近做原核表达，但是目的片段和质粒都双酶切后连接不成功，不知道是什么问题，请各位赐教！

回复此楼

可以朝九晚五，也能浪迹天涯

1楼2011-04-12 22:06:01

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

csdyg

木虫 (正式写手)

MolEPI: 4
应助: 6 (幼儿园)
金币: 3737.5
散金: 277
红花: 9
帖子: 422
在线: 529.6小时
虫号: 94520
注册: 2005-09-27
专业: 生物大分子结构与功能

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+3): 感谢分享经验 2011-04-14 11:54:29

双酶切连接转化做了好多了，有几点小小经验也分享一下。
1. 双酶切酶的选择，如果只能选固定的酶，那根据公司推荐选择合适的双酶切buffer，如果没有合适buffer，可进行分步酶切。酶切体系一般在30-100ul为宜。如果使用的酶没有星号活性的情况下，适当增加酶切时间。
2. 个人感觉在酶切回收过程中需要注意的地方是胶回收，酶切后应尽量避免胶回收，避免紫外照射，我做的时候一般是克隆质粒上或者PCR产物后的插入片段进行胶回收，表达载体酶切后直接沉降，因为载体一般较大，充分酶切打开后，短时间内沉降小片段不容易回收，而载体一般都可以回收得到，同时洗的时候又可以把小片段洗除。
3. 掌握好插入片段和载体的配比，有公式可以计算，载体浓度低一点问题不大。

也可以说一下你的详细步骤，大家再讨论

赞一下(2人)

回复此楼

6楼2011-04-14 03:13:55

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

查看全部 10 个回答

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

专家经验: +57
MolEPI: 106
应助: 95 (初中生)
贵宾: 0.263
金币: 16382.3
散金: 593
红花: 74
沙发: 9
帖子: 3648
在线: 288.2小时
虫号: 441757
注册: 2007-10-27
专业: 微生物生理与生物化学
管辖: 微生物

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+2, EPI+1): 分析得很全面了，赞！ 2011-04-12 23:53:46

1：质粒酶切的是否彻底，还有基因呢？如果酶切的不够彻底的话，肯定影响连接效率了；
2：你连接体系的设计，如果基因和质粒的量不合适，也会影响连接效率滴；
3：连接时间呢？
4：筛选过程，你可以先进行PCR验证，然后提取质粒酶切进行验证。

总之这个连接转化是分子生物学最基础的技术了，一定得扎实了，这样对于后期实验有很大帮助。
祝好运！

赞一下(2人)

回复此楼

Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!

2楼2011-04-12 22:23:16

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖