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475502411

铜虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】连接转化 已有8人参与

我最近做原核表达，但是目的片段和质粒都双酶切后连接不成功，不知道是什么问题，请各位赐教！
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1楼 2011-04-12 22:06:01
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yu棒棒

新虫 (初入文坛)
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682241楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-13 13:31:39
1.片段和载体的质量是首先要保证的。片段注意尽量不要有其他条带的污染，尤其是小条带（小条带的连接效率是远远大于大条带的）
2.关于酶切：限制性内切酶对 线性DNA的切割效率要稍低于环状的质粒，因此要适当延长 ...

老师，您好！ 我现在一般是用ECOR 1 和NOT 1对表达载体pPIC9K、pPIC3.5K进行双酶切，酶切后跑胶的确不能看到切下的小片段，您说建议进行分步酶切，那分步酶切的条件一般怎么，每一步酶切大概需要多久，酶切后我需要跑胶，然后切胶回收吗？
     初次接触双酶切，有很多问题，希望能得到老师的回复，谢谢！
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9楼2012-06-18 21:26:20
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yu棒棒

新虫 (初入文坛)
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引用回帖:
713222楼: Originally posted by csdyg at 2011-04-14 03:13:55
双酶切连接转化做了好多了，有几点小小经验也分享一下。
1. 双酶切酶的选择，如果只能选固定的酶，那根据公司推荐选择合适的双酶切buffer，如果没有合适buffer，可进行分步酶切。酶切体系一般在30-100ul为宜。如果 ...

老师，您好！ 看了您的经验，我对第二条不是很明白，您的意思是表达载体酶切后不要回收么？可是您后来解释说载体一般可以回收得到，是什么意思？
今天我第一次做双酶切，酶切后跑胶，看到酶切效果不错，然后我做了胶回收，可是克隆质粒上切下的插入片段回收到了，表达载体的却没有回收到。老师，我不应该将表达载体做胶回收么？
初次接触这一块，有很多问题，想恳请老师批评指正。谢谢！
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10楼2012-06-18 21:33:10
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