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铜虫 (著名写手)

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[交流] 【求助/交流】连接转化已有8人参与

我最近做原核表达，但是目的片段和质粒都双酶切后连接不成功，不知道是什么问题，请各位赐教！

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可以朝九晚五，也能浪迹天涯

1楼2011-04-12 22:06:01

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yu棒棒

新虫 (初入文坛)

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★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

引用回帖:

713222楼: Originally posted by csdyg at 2011-04-14 03:13:55
双酶切连接转化做了好多了，有几点小小经验也分享一下。
1. 双酶切酶的选择，如果只能选固定的酶，那根据公司推荐选择合适的双酶切buffer，如果没有合适buffer，可进行分步酶切。酶切体系一般在30-100ul为宜。如果 ...

老师，您好！看了您的经验，我对第二条不是很明白，您的意思是表达载体酶切后不要回收么？可是您后来解释说载体一般可以回收得到，是什么意思？
今天我第一次做双酶切，酶切后跑胶，看到酶切效果不错，然后我做了胶回收，可是克隆质粒上切下的插入片段回收到了，表达载体的却没有回收到。老师，我不应该将表达载体做胶回收么？
初次接触这一块，有很多问题，想恳请老师批评指正。谢谢！

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10楼2012-06-18 21:33:10

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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

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★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+2, EPI+1): 分析得很全面了，赞！ 2011-04-12 23:53:46

1：质粒酶切的是否彻底，还有基因呢？如果酶切的不够彻底的话，肯定影响连接效率了；
2：你连接体系的设计，如果基因和质粒的量不合适，也会影响连接效率滴；
3：连接时间呢？
4：筛选过程，你可以先进行PCR验证，然后提取质粒酶切进行验证。

总之这个连接转化是分子生物学最基础的技术了，一定得扎实了，这样对于后期实验有很大帮助。
祝好运！

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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!

2楼2011-04-12 22:23:16

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