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475502411

铜虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】连接转化已有8人参与

我最近做原核表达,但是目的片段和质粒都双酶切后连接不成功,不知道是什么问题,请各位赐教!
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yu棒棒

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
送鲜花一朵
引用回帖:
682241楼: Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-13 13:31:39
1.片段和载体的质量是首先要保证的。片段注意尽量不要有其他条带的污染,尤其是小条带(小条带的连接效率是远远大于大条带的)
2.关于酶切:限制性内切酶对 线性DNA的切割效率要稍低于环状的质粒,因此要适当延长 ...

老师,您好! 我现在一般是用ECOR 1 和NOT 1对表达载体pPIC9K、pPIC3.5K进行双酶切,酶切后跑胶的确不能看到切下的小片段,您说建议进行分步酶切,那分步酶切的条件一般怎么,每一步酶切大概需要多久,酶切后我需要跑胶,然后切胶回收吗?
     初次接触双酶切,有很多问题,希望能得到老师的回复,谢谢!
9楼2012-06-18 21:26:20
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
西瓜(金币+2, EPI+1): 分析得很全面了,赞! 2011-04-12 23:53:46
1:质粒酶切的是否彻底,还有基因呢?如果酶切的不够彻底的话,肯定影响连接效率了;
2:你连接体系的设计,如果基因和质粒的量不合适,也会影响连接效率滴;
3:连接时间呢?
4:筛选过程,你可以先进行PCR验证,然后提取质粒酶切进行验证。

总之这个连接转化是分子生物学最基础的技术了,一定得扎实了,这样对于后期实验有很大帮助。
祝好运!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-04-12 22:23:16
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
西瓜(金币+3): 个人也觉得双酶切出问题可能性比较大 2011-04-12 23:54:35
引用回帖:
Originally posted by 475502411 at 2011-04-12 22:06:01:
我最近做原核表达,但是目的片段和质粒都双酶切后连接不成功,不知道是什么问题,请各位赐教!

双酶切有问题~

见帖子http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3062980
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
3楼2011-04-12 22:23:44
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xiaoyu1014126

木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-04-14 11:53:44
1.酶连16℃过夜
2.酶连体系10ul比较好,常规是小体积酶连,大体积酶切
3.双酶切可以分两步单酶切完成,第一次用便宜的酶切后回收在切第二个
4.酶连体系的目的片段和质粒摩尔比要控制好(1:3~1:10),有条件的话核酸定量仪测定要浓度,也可以做几个梯度比例
4楼2011-04-13 12:23:35
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