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| 我最近做原核表达，但是目的片段和质粒都双酶切后连接不成功，不知道是什么问题，请各位赐教！ |
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空谷幽风
金虫 (正式写手)
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+3): 感谢分享 2011-04-14 11:54:42
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1.片段和载体的质量是首先要保证的。片段注意尽量不要有其他条带的污染，尤其是小条带（小条带的连接效率是远远大于大条带的） 2.关于酶切：限制性内切酶对 线性DNA的切割效率要稍低于环状的质粒，因此要适当延长PCR片段的酶切时间；还有PCR产物两端的酶切位点前有没有加足够的保护碱基，裸露的酶切位点是无法酶切的；在进行双酶切时，载体上如果两个酶切位点离得比较近(即切完后无法通过跑胶看到切下的小片段)建议不要进行一步双酶切，而是要分步酶切，这样比较保险；酶切完后PCR片段可以直接过柱回收，质粒最好割胶回收。 3.关于连接：只要控制好片段载体的比例，抗性弄不错的话按操作规程来是不会出现什么问题的 |
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yu棒棒5楼2011-04-13 13:31:39