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475502411

铜虫 (著名写手)

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[交流] 【求助/交流】连接转化已有8人参与

我最近做原核表达，但是目的片段和质粒都双酶切后连接不成功，不知道是什么问题，请各位赐教！

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可以朝九晚五，也能浪迹天涯

1楼2011-04-12 22:06:01

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空谷幽风

金虫 (正式写手)

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★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+3): 感谢分享 2011-04-14 11:54:42

引用回帖:

Originally posted by 475502411 at 2011-04-12 22:06:01:
我最近做原核表达，但是目的片段和质粒都双酶切后连接不成功，不知道是什么问题，请各位赐教！

1.片段和载体的质量是首先要保证的。片段注意尽量不要有其他条带的污染，尤其是小条带（小条带的连接效率是远远大于大条带的）
2.关于酶切：限制性内切酶对线性DNA的切割效率要稍低于环状的质粒，因此要适当延长PCR片段的酶切时间；还有PCR产物两端的酶切位点前有没有加足够的保护碱基，裸露的酶切位点是无法酶切的；在进行双酶切时，载体上如果两个酶切位点离得比较近(即切完后无法通过跑胶看到切下的小片段)建议不要进行一步双酶切，而是要分步酶切，这样比较保险；酶切完后PCR片段可以直接过柱回收，质粒最好割胶回收。
3.关于连接：只要控制好片段载体的比例，抗性弄不错的话按操作规程来是不会出现什么问题的

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yu棒棒

a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?

5楼2011-04-13 13:31:39

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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

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★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
西瓜(金币+2, EPI+1): 分析得很全面了，赞！ 2011-04-12 23:53:46

1：质粒酶切的是否彻底，还有基因呢？如果酶切的不够彻底的话，肯定影响连接效率了；
2：你连接体系的设计，如果基因和质粒的量不合适，也会影响连接效率滴；
3：连接时间呢？
4：筛选过程，你可以先进行PCR验证，然后提取质粒酶切进行验证。

总之这个连接转化是分子生物学最基础的技术了，一定得扎实了，这样对于后期实验有很大帮助。
祝好运！

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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!

2楼2011-04-12 22:23:16

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