Originally posted by xulanzzz at 2010-11-11 10:35:33:
首先 看看Marker 说明你的胶做的不是很好，当然胶不是最主要的问题。模板时间有多长了，是否已经降解？？其次，应该从两方面来考虑：一是PCR产物自身的原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度 ...

Originally posted by blackrose8089 at 2010-11-11 13:07:22:
楼主是要找flangking region吗？

Originally posted by wangy0908 at 2010-11-11 19:53:30:

就是，找侧翼序列。因为基因发生了突变，不知道侧翼序列是插入还是丢失了。直接扩增也扩不出来。整个基因组的序列是知道的。以及现在突变的大致范围已经确定，所以想通过inverser pcr来确定精确的突变起始点。

Originally posted by bigboy123 at 2010-11-12 10:03:20:
两次PCR不要用相同的引物，否则一般经常会弥散的。
最后一步把延伸时间延长点。

Originally posted by blackrose8089 at 2010-11-12 13:01:06:

如果是这样的话，楼主不妨换下刘老师的TAIL PCR技术，如果是用的拟南芥T-DNA插入的话，Salk institute有现成的引物可参考一下！

Originally posted by bigboy123 at 2010-11-13 10:12:34:
大概看了一下，你是第一次PCR没有出来吧，一般再扩二次PCR是没有意义的，不用去做，除非是巢式PCR。
应该探讨你第一次为什么没有扩增出来。你需要对你每一步操作进行确认，包括模板是否可靠。