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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】这种PCR结果是为什么
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wangy0908

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】这种PCR结果是为什么

这段时间做的pcr,在1%的gel电泳。重复了几次都是密散的。
是做的Inverse PCR, 酶切后自连接，自连接的DNA用量是10ng，50ul体系。取2ul做第一次pcr， 第一次PCR产物稀释200倍，取2ul做第二次pcr。图片就是第二次pcr产物。第一次的pcr产物电泳没有任何结果。
请教各位高人指点指点！！
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1楼2010-11-11 03:16:59
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randomqd

木虫 (小有名气)

有可能是loading

wangy0908(金币+1): 2010-11-11 19:57:37
看一下上样buf有没有问题。。。
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2楼2010-11-11 08:31:35
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magy2006

木虫 (著名写手)
wangy0908(金币+1): 2010-11-11 19:43:40
模板浓度极高外加循环数极多
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3楼2010-11-11 08:37:36
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aaron2012

银虫 (初入文坛)
下次建议时间跑长点  你看Marker都没有完全分开
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4楼2010-11-11 09:33:23
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haha61

铁杆木虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-11 10:20:27
wangy0908(金币+1): 2010-11-11 19:43:53
Marker 没有问题，应该是DNA浓度的问题或是DNA降解！DNA浓度过高了！
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5楼2010-11-11 09:36:50
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xulanzzz

金虫 (著名写手)
★ ★
wangy0908(金币+2): 2010-11-11 19:46:08
dhd997(金币+2):good 2010-11-12 10:01:18
首先 看看Marker 说明你的胶做的不是很好，当然胶不是最主要的问题。模板时间有多长了，是否已经降解？？其次，应该从两方面来考虑：一是PCR产物自身的原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，而造成PCR的非特异性产物过多。
对策：①减少Taq酶的量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少引物的用量，减少循环次数，提高退火温度。
二是电泳体系的问题：
（1）电泳缓冲液TAE或者TBE的污染，建议更换缓冲液。（2）上样时样品漂了，建议增加上样缓冲液的用量，以及小心加样。（3）电压太高，看你的Marker就觉得你们的电泳缓冲液需要换了。。。
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6楼2010-11-11 10:35:33
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蓝天白云haha

银虫 (正式写手)
wangy0908(金币+1): 2010-11-11 19:58:01
弥散DNA的原因：核酸酶降解DNA、电泳条件不正确、凝胶迁移效应、DNA上样过量、样品的盐浓度过高、凝胶点样孔质量差
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7楼2010-11-11 11:56:32
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
楼主是要找flangking region吗？
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8楼2010-11-11 13:07:22
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xulanzzz at 2010-11-11 10:35:33:
首先 看看Marker 说明你的胶做的不是很好，当然胶不是最主要的问题。模板时间有多长了，是否已经降解？？其次，应该从两方面来考虑：一是PCR产物自身的原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度 ...

点击缓冲液是新配的，电压我用的80v。也就说电泳是应该没有问题的。但是我可能用的酶量太高了，我用的是0.5ul Program的酶，以及循环36.
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9楼2010-11-11 19:49:48
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by blackrose8089 at 2010-11-11 13:07:22:
楼主是要找flangking region吗？

就是，找侧翼序列。因为基因发生了突变，不知道侧翼序列是插入还是丢失了。直接扩增也扩不出来。整个基因组的序列是知道的。以及现在突变的大致范围已经确定，所以想通过inverser pcr来确定精确的突变起始点。
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10楼2010-11-11 19:53:30
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wangy0908

金虫 (正式写手)
另外，这个结果有没有可能也是没有扩增出来的问题的？也就是说PCR根本没有反应的！
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11楼2010-11-12 09:59:10
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bigboy123

铜虫 (小有名气)
★
wangy0908(金币+2): 2010-11-12 22:05:09
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-14 08:40:18
两次PCR不要用相同的引物，否则一般经常会弥散的。
最后一步把延伸时间延长点。
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12楼2010-11-12 10:03:20
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
wangy0908(金币+2): 2010-11-12 22:05:24
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2010-11-11 19:53:30:

就是，找侧翼序列。因为基因发生了突变，不知道侧翼序列是插入还是丢失了。直接扩增也扩不出来。整个基因组的序列是知道的。以及现在突变的大致范围已经确定，所以想通过inverser pcr来确定精确的突变起始点。

如果是这样的话，楼主不妨换下刘老师的TAIL PCR技术，如果是用的拟南芥T-DNA插入的话，Salk institute有现成的引物可参考一下！
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13楼2010-11-12 13:01:06
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by bigboy123 at 2010-11-12 10:03:20:
两次PCR不要用相同的引物，否则一般经常会弥散的。
最后一步把延伸时间延长点。

我两次就是用的相同的引物。因为在有限的片段内不好设计两对引物出来！那\一对能不能扩曾出来的呢。
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14楼2010-11-12 22:07:50
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by blackrose8089 at 2010-11-12 13:01:06:

如果是这样的话，楼主不妨换下刘老师的TAIL PCR技术，如果是用的拟南芥T-DNA插入的话，Salk institute有现成的引物可参考一下！

我用的是大豆材料。突变是由元缘杂交引起的。不知道是插入还是缺失！
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15楼2010-11-12 22:09:11
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bigboy123

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-11-14 08:40:30
大概看了一下，你是第一次PCR没有出来吧，一般再扩二次PCR是没有意义的，不用去做，除非是巢式PCR。
应该探讨你第一次为什么没有扩增出来。你需要对你每一步操作进行确认，包括模板是否可靠。
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16楼2010-11-13 10:12:34
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
换引物吧
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17楼2010-11-13 11:49:16
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by bigboy123 at 2010-11-13 10:12:34:
大概看了一下，你是第一次PCR没有出来吧，一般再扩二次PCR是没有意义的，不用去做，除非是巢式PCR。
应该探讨你第一次为什么没有扩增出来。你需要对你每一步操作进行确认，包括模板是否可靠。

就是做的巢式PCR的。
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18楼2010-11-14 00:57:07
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dayulee

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
marker也没有跑好这个问题不是关键。肯定的是你的条带确实特异性很差，你可以根据上面老师的回复去考虑，另外稍微做个温度梯度的PCR，再跑胶看看。你的marker选择也不太合适，条带太多了，你要是条带大小已知的话，你换个适合大小的marker。祝你成功。
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19楼2012-08-06 11:16:35
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