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wangy0908

金虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】这种PCR结果是为什么

这段时间做的pcr,在1%的gel电泳。重复了几次都是密散的。
是做的Inverse PCR, 酶切后自连接，自连接的DNA用量是10ng，50ul体系。取2ul做第一次pcr，第一次PCR产物稀释200倍，取2ul做第二次pcr。图片就是第二次pcr产物。第一次的pcr产物电泳没有任何结果。
请教各位高人指点指点！！

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1楼 2010-11-11 03:16:59

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xulanzzz

金虫 (著名写手)

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★ ★
wangy0908(金币+2): 2010-11-11 19:46:08
dhd997(金币+2):good 2010-11-12 10:01:18

首先看看Marker 说明你的胶做的不是很好，当然胶不是最主要的问题。模板时间有多长了，是否已经降解？？其次，应该从两方面来考虑：一是PCR产物自身的原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，而造成PCR的非特异性产物过多。
对策：①减少Taq酶的量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少引物的用量，减少循环次数，提高退火温度。
二是电泳体系的问题：
（1）电泳缓冲液TAE或者TBE的污染，建议更换缓冲液。（2）上样时样品漂了，建议增加上样缓冲液的用量，以及小心加样。（3）电压太高，看你的Marker就觉得你们的电泳缓冲液需要换了。。。