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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】这种PCR结果是为什么
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wangy0908

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】这种PCR结果是为什么

这段时间做的pcr,在1%的gel电泳。重复了几次都是密散的。
是做的Inverse PCR, 酶切后自连接，自连接的DNA用量是10ng，50ul体系。取2ul做第一次pcr， 第一次PCR产物稀释200倍，取2ul做第二次pcr。图片就是第二次pcr产物。第一次的pcr产物电泳没有任何结果。
请教各位高人指点指点！！
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1楼 2010-11-11 03:16:59
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xulanzzz

金虫 (著名写手)
★ ★
wangy0908(金币+2): 2010-11-11 19:46:08
dhd997(金币+2):good 2010-11-12 10:01:18
首先 看看Marker 说明你的胶做的不是很好，当然胶不是最主要的问题。模板时间有多长了，是否已经降解？？其次，应该从两方面来考虑：一是PCR产物自身的原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多，而造成PCR的非特异性产物过多。
对策：①减少Taq酶的量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少引物的用量，减少循环次数，提高退火温度。
二是电泳体系的问题：
（1）电泳缓冲液TAE或者TBE的污染，建议更换缓冲液。（2）上样时样品漂了，建议增加上样缓冲液的用量，以及小心加样。（3）电压太高，看你的Marker就觉得你们的电泳缓冲液需要换了。。。
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6楼2010-11-11 10:35:33
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randomqd

木虫 (小有名气)

有可能是loading

wangy0908(金币+1): 2010-11-11 19:57:37
看一下上样buf有没有问题。。。
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2楼2010-11-11 08:31:35
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magy2006

木虫 (著名写手)
wangy0908(金币+1): 2010-11-11 19:43:40
模板浓度极高外加循环数极多
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3楼2010-11-11 08:37:36
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aaron2012

银虫 (初入文坛)
下次建议时间跑长点  你看Marker都没有完全分开
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4楼2010-11-11 09:33:23
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