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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】这种PCR结果是为什么
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wangy0908

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】这种PCR结果是为什么

这段时间做的pcr,在1%的gel电泳。重复了几次都是密散的。
是做的Inverse PCR, 酶切后自连接，自连接的DNA用量是10ng，50ul体系。取2ul做第一次pcr， 第一次PCR产物稀释200倍，取2ul做第二次pcr。图片就是第二次pcr产物。第一次的pcr产物电泳没有任何结果。
请教各位高人指点指点！！
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1楼 2010-11-11 03:16:59
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by xulanzzz at 2010-11-11 10:35:33:
首先 看看Marker 说明你的胶做的不是很好，当然胶不是最主要的问题。模板时间有多长了，是否已经降解？？其次，应该从两方面来考虑：一是PCR产物自身的原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度 ...

点击缓冲液是新配的，电压我用的80v。也就说电泳是应该没有问题的。但是我可能用的酶量太高了，我用的是0.5ul Program的酶，以及循环36.
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9楼2010-11-11 19:49:48
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by blackrose8089 at 2010-11-11 13:07:22:
楼主是要找flangking region吗？

就是，找侧翼序列。因为基因发生了突变，不知道侧翼序列是插入还是丢失了。直接扩增也扩不出来。整个基因组的序列是知道的。以及现在突变的大致范围已经确定，所以想通过inverser pcr来确定精确的突变起始点。
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10楼2010-11-11 19:53:30
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wangy0908

金虫 (正式写手)
另外，这个结果有没有可能也是没有扩增出来的问题的？也就是说PCR根本没有反应的！
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11楼2010-11-12 09:59:10
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by bigboy123 at 2010-11-12 10:03:20:
两次PCR不要用相同的引物，否则一般经常会弥散的。
最后一步把延伸时间延长点。

我两次就是用的相同的引物。因为在有限的片段内不好设计两对引物出来！那\一对能不能扩曾出来的呢。
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14楼2010-11-12 22:07:50
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by blackrose8089 at 2010-11-12 13:01:06:

如果是这样的话，楼主不妨换下刘老师的TAIL PCR技术，如果是用的拟南芥T-DNA插入的话，Salk institute有现成的引物可参考一下！

我用的是大豆材料。突变是由元缘杂交引起的。不知道是插入还是缺失！
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15楼2010-11-12 22:09:11
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wangy0908

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by bigboy123 at 2010-11-13 10:12:34:
大概看了一下，你是第一次PCR没有出来吧，一般再扩二次PCR是没有意义的，不用去做，除非是巢式PCR。
应该探讨你第一次为什么没有扩增出来。你需要对你每一步操作进行确认，包括模板是否可靠。

就是做的巢式PCR的。
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18楼2010-11-14 00:57:07
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