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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】pET载体酶切
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xiangao

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】pET载体酶切 已有4人参与

pET系列的载体很容易切散掉，大家有没有好的建议？
比如双酶切BamHI+XhoI,同时双酶切3个小时可以吗？
转化菌假阳性应该很多
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1楼 2009-12-15 17:40:52
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lzhwin

木虫 (正式写手)
★
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正常情况是不会发生这种问题的：
1、楼主是用DH5α提质粒吗?一般的表达菌株像BL21这样的因为没有突变核酸酶会这样。

2、检查一下酶切用的buffer可能污染了，换一管试试。

3、如果是手提质粒，请在乙醇沉淀之前加一步酚氯仿抽提把蛋白除干净，后面溶解时加rnase去RNA

4、如果是试剂盒提不要忘了用试剂盒里的除蛋白buffer。菌的用量不要超过试剂盒规定的极限。

5、双酶切的时间要看你的体系，如果按照说明书上的比例做应该问题不大。
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2楼2009-12-15 19:30:19
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apple-z

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
应该没问题 我做酶切通常就切2小时
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3楼2009-12-15 19:38:05
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yiyiglad

★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这个载体很好使，假阳性也不是很高，按照说明书做应该没什么问题，酶切3个小时应该没有问题。个人认为主要还是要看一下是不是buffer的问题。
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4楼2009-12-15 19:42:10
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TAMAHOME

金虫 (小有名气)
pet载体我双酶切没事，很好切，感觉也不容易切散掉，载体提取质粒的质量还是蛮重要的。
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让死者有那不朽的名，但让生者有那不朽的爱──
5楼2009-12-15 21:25:20
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xiangao

金虫 (正式写手)
谢谢各位回复
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6楼2009-12-15 22:54:47
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忘记将来

木虫 (正式写手)
★
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恩，应该没有问题，我们切一般都切2个小时的，效果也蛮好的。体系中镁离子的含量挺重要。
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7楼2009-12-16 14:18:01
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sikao

呵呵，我也遇到了类似的问题，在此谢谢各位大侠的帮助！

8楼2011-04-12 20:00:42
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roomofxw

木虫 (正式写手)
★
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切散掉？没发现，pET除了拷贝提不好提质粒外，挺好用的
过夜双酶切都没有发现问题
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9楼2011-04-13 08:31:50
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sfb1020

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我是PET44a双酶切4个小时没有问题
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10楼2011-04-13 09:12:33
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