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xiangao

金虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】pET载体酶切已有4人参与

pET系列的载体很容易切散掉，大家有没有好的建议？
比如双酶切BamHI+XhoI,同时双酶切3个小时可以吗？
转化菌假阳性应该很多

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1楼 2009-12-15 17:40:52

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TAMAHOME

金虫 (小有名气)

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pet载体我双酶切没事，很好切，感觉也不容易切散掉，载体提取质粒的质量还是蛮重要的。

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让死者有那不朽的名，但让生者有那不朽的爱──

5楼2009-12-15 21:25:20

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lzhwin

木虫 (正式写手)

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★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流

正常情况是不会发生这种问题的：
1、楼主是用DH5α提质粒吗?一般的表达菌株像BL21这样的因为没有突变核酸酶会这样。

2、检查一下酶切用的buffer可能污染了，换一管试试。

3、如果是手提质粒，请在乙醇沉淀之前加一步酚氯仿抽提把蛋白除干净，后面溶解时加rnase去RNA

4、如果是试剂盒提不要忘了用试剂盒里的除蛋白buffer。菌的用量不要超过试剂盒规定的极限。

5、双酶切的时间要看你的体系，如果按照说明书上的比例做应该问题不大。

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2楼2009-12-15 19:30:19

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