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xiangao

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】pET载体酶切 已有4人参与

pET系列的载体很容易切散掉,大家有没有好的建议?
比如双酶切BamHI+XhoI,同时双酶切3个小时可以吗?
转化菌假阳性应该很多
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yiyiglad


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
这个载体很好使,假阳性也不是很高,按照说明书做应该没什么问题,酶切3个小时应该没有问题。个人认为主要还是要看一下是不是buffer的问题。
4楼2009-12-15 19:42:10
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lzhwin

木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
正常情况是不会发生这种问题的:
1、楼主是用DH5α提质粒吗?一般的表达菌株像BL21这样的因为没有突变核酸酶会这样。

2、检查一下酶切用的buffer可能污染了,换一管试试。

3、如果是手提质粒,请在乙醇沉淀之前加一步酚氯仿抽提把蛋白除干净,后面溶解时加rnase去RNA

4、如果是试剂盒提不要忘了用试剂盒里的除蛋白buffer。菌的用量不要超过试剂盒规定的极限。

5、双酶切的时间要看你的体系,如果按照说明书上的比例做应该问题不大。
2楼2009-12-15 19:30:19
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apple-z

银虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
应该没问题 我做酶切通常就切2小时
3楼2009-12-15 19:38:05
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TAMAHOME

金虫 (小有名气)

pet载体我双酶切没事,很好切,感觉也不容易切散掉,载体提取质粒的质量还是蛮重要的。
让死者有那不朽的名,但让生者有那不朽的爱──
5楼2009-12-15 21:25:20
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