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载体、目的基因双酶切、连接问题 已有17人参与
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各位大侠，帮我分析下PET-28a载体上用BamH I、Sal I酶切能切开吗？，序列见图。两个位点相差13bp，还有我在目的基因上设计酶切引物，引物前方只加了三个保护性碱基，这样子行不？我连接了好久了都没连接上。我用的酶是TAKARA的，按照公司推荐的载体切2-3小时，800多bp的目的切2小时。两个酶buffer不一样，有10xT的公用buffer，反应温度也不一样，BamH I30℃，Sal I37℃，按照takara推荐的公用buffer以及37℃酶切，直接双酶切以及分步酶切都试过了，挑取的阳性克隆，提质粒后与原始载体大小接近，目的基因未连接成功 ，有没有什么方法能够证明双酶切切开了？ 1.png |
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14楼2016-08-04 10:15:50
原海亮
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空载载体的处理确实容易出现这样情况，可以将回收后的载体重复二次酶切试试，保证酶切完全。或者可以找实验室心里构建好的pET+目的片段的载体，那它作为出发载体进行双酶切（当然这个载体上保留着你需要的双酶切位点），这样你回收载体时候，就可以同过看有没有目的条带切出来，来判断载体的酶切情况。第二，片段的处理，首先确定所选的酶为在目的片段里不存在，然后酶切处理同样要求尽可能的酶切完全，很多人为了避免后面出现类似麻烦的事情，可以把pcr产物连接T载体，一方面可以送测序验证是否正确后，再安排接下来实验。另一方面，这样做你酶切目的片段时候，就可以通过回收从T载体上切下来的片段进行连接转化，祝好！ 发自小木虫Android客户端 |
3楼2016-03-23 12:18:32
2楼2016-03-23 11:26:48
4楼2016-03-24 21:44:23
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不好检测，可以把胶的浓度提高 发自小木虫Android客户端 |
5楼2016-03-24 22:25:35
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总琼脂糖凝胶电泳检测。一个原质粒做对照，一个双酶切，两个单酶切。成像规律，最下边是原质粒对照，其次是双酶切，最上边是两条单酶切的带。有细微差别。参考。 发自小木虫Android客户端 |
6楼2016-03-26 20:46:20
7楼2016-03-26 20:56:17
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8楼2016-03-28 17:38:58
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很简单啊，你设置一组对照就知道有木有切开啊 发自小木虫IOS客户端 |
9楼2016-03-31 12:18:06
想学好的学渣
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用他们公司的快切酶，最好不要用sal I那个酶。三个保护碱基够了。你要保证你插入的片段不会造成移码突变。另外载体和片段配比也要保证好。推荐全式金的原核表达的载体，用着还可以 发自小木虫IOS客户端 |
10楼2016-03-31 14:39:11
