载体、目的基因双酶切、连接问题 - 分子生物 - DNA重组 - 第2页小木虫论坛-学术科研互动平台

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小秀子子

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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-04 06:48:30

可以适当延长酶切时间，确保酶切完全

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11楼2016-03-31 20:20:33

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海忆梦奇

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★
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你好！我想问问你，酶切位点是如何选择的？

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12楼2016-04-27 10:45:01

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baishaoyun

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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-04 06:48:47

引用回帖:

10楼: Originally posted by 想学好的学渣 at 2016-03-31 14:39:11
用他们公司的快切酶，最好不要用sal I那个酶。三个保护碱基够了。你要保证你插入的片段不会造成移码突变。另外载体和片段配比也要保证好。推荐全式金的原核表达的载体，用着还可以
...

为何尽量不用SAC I？

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13楼2016-08-03 23:44:31

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小静儿000

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我的实验也碰到了相同的问题，连了好久都没成功，后来实验室师兄教给我用同源重组的方法进行克隆，结果就连上了，而且目的片段不用酶切，直接把载体酶切之后用Dnp1酶消化一下就没有环状质粒了，不会有假阳性的，我用的是Vazyme的同源重组克隆试剂盒，你可以试试

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14楼2016-08-04 10:15:50

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浮笙若梦

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引用回帖:

14楼: Originally posted by 小静儿000 at 2016-08-04 10:15:50
我的实验也碰到了相同的问题，连了好久都没成功，后来实验室师兄教给我用同源重组的方法进行克隆，结果就连上了，而且目的片段不用酶切，直接把载体酶切之后用Dnp1酶消化一下就没有环状质粒了，不会有假阳性的，我用 ...

觉得同源重组的方法还是挺好的，连接效率会比较高

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15楼2016-08-04 10:43:29

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