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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体、目的基因双酶切、连接问题
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小秀子子

新虫 (初入文坛)
★ ★
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xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-04 06:48:30
可以适当延长酶切时间，确保酶切完全
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11楼2016-03-31 20:20:33
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海忆梦奇

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你好！我想问问你，酶切位点是如何选择的？
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12楼2016-04-27 10:45:01
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baishaoyun

新虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-04 06:48:47
引用回帖:
10楼: Originally posted by 想学好的学渣 at 2016-03-31 14:39:11
用他们公司的快切酶，最好不要用sal I那个酶。三个保护碱基够了。你要保证你插入的片段不会造成移码突变。另外载体和片段配比也要保证好。推荐全式金的原核表达的载体，用着还可以
...

为何尽量不用SAC I？

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13楼2016-08-03 23:44:31
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小静儿000

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我的实验也碰到了相同的问题，连了好久都没成功，后来实验室师兄教给我用同源重组的方法进行克隆，结果就连上了，而且目的片段不用酶切，直接把载体酶切之后用Dnp1酶消化一下就没有环状质粒了，不会有假阳性的，我用的是Vazyme的同源重组克隆试剂盒，你可以试试
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14楼2016-08-04 10:15:50
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浮笙若梦

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
14楼: Originally posted by 小静儿000 at 2016-08-04 10:15:50
我的实验也碰到了相同的问题，连了好久都没成功，后来实验室师兄教给我用同源重组的方法进行克隆，结果就连上了，而且目的片段不用酶切，直接把载体酶切之后用Dnp1酶消化一下就没有环状质粒了，不会有假阳性的，我用 ...

觉得同源重组的方法还是挺好的，连接效率会比较高
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15楼2016-08-04 10:43:29
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swgcpy

至尊木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
这么近的位点，可能会影响双酶切效率，可以先单酶切成线性，沉淀或者切胶回收，再次用另一个酶切，切胶回收

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16楼2016-08-12 00:05:57
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踏云逐月

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
设置一个单酶切对照看看呗！
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17楼2016-08-12 11:43:52
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korchagin

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
酶切是能切开的，但不应该用37度一刀切，建议先用低温切在调成高温切
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18楼2016-08-12 15:16:50
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