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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体、目的基因双酶切、连接问题
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549088894

新虫 (小有名气)

[交流] 载体、目的基因双酶切、连接问题 已有17人参与

各位大侠，帮我分析下PET-28a载体上用BamH I、Sal I酶切能切开吗？，序列见图。两个位点相差13bp，还有我在目的基因上设计酶切引物，引物前方只加了三个保护性碱基，这样子行不？我连接了好久了都没连接上。我用的酶是TAKARA的，按照公司推荐的载体切2-3小时，800多bp的目的切2小时。两个酶buffer不一样，有10xT的公用buffer，反应温度也不一样，BamH I30℃，Sal I37℃，按照takara推荐的公用buffer以及37℃酶切，直接双酶切以及分步酶切都试过了，挑取的阳性克隆，提质粒后与原始载体大小接近，目的基因未连接成功，有没有什么方法能够证明双酶切切开了？

载体、目的基因双酶切、连接问题
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1楼 2016-03-23 10:30:53
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小静儿000

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我的实验也碰到了相同的问题，连了好久都没成功，后来实验室师兄教给我用同源重组的方法进行克隆，结果就连上了，而且目的片段不用酶切，直接把载体酶切之后用Dnp1酶消化一下就没有环状质粒了，不会有假阳性的，我用的是Vazyme的同源重组克隆试剂盒，你可以试试
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14楼2016-08-04 10:15:50
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卡维斯

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-04 06:47:36
可以试一下用高浓度 的胶去跑电泳，多跑会，然后用凝胶成像里面的负片模式拍照。我们实验有做过切下25bp的.
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2楼2016-03-23 11:26:48
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原海亮

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-08-04 06:43:14
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-08-04 06:45:11
空载载体的处理确实容易出现这样情况，可以将回收后的载体重复二次酶切试试，保证酶切完全。或者可以找实验室心里构建好的pET+目的片段的载体，那它作为出发载体进行双酶切（当然这个载体上保留着你需要的双酶切位点），这样你回收载体时候，就可以同过看有没有目的条带切出来，来判断载体的酶切情况。第二，片段的处理，首先确定所选的酶为在目的片段里不存在，然后酶切处理同样要求尽可能的酶切完全，很多人为了避免后面出现类似麻烦的事情，可以把pcr产物连接T载体，一方面可以送测序验证是否正确后，再安排接下来实验。另一方面，这样做你酶切目的片段时候，就可以通过回收从T载体上切下来的片段进行连接转化，祝好！

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
3楼2016-03-23 12:18:32
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Bearxionghui

新虫 (初入文坛)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-04 06:46:04
检验双酶切是否切开，可以用琼脂糖凝胶电泳，把酶切产物与原质粒电泳，正常情况，酶切后迁移率较慢，条带在原质粒后。或者你可以试试TAKARA的快切酶，时间快而且酶切缓冲液一样，可以同时双酶切。
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鐩镐俊鑷繁锛?
4楼2016-03-24 21:44:23
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