| 查看: 9940 | 回复: 17 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
载体、目的基因双酶切、连接问题 已有17人参与
|
|||
各位大侠，帮我分析下PET-28a载体上用BamH I、Sal I酶切能切开吗？，序列见图。两个位点相差13bp，还有我在目的基因上设计酶切引物，引物前方只加了三个保护性碱基，这样子行不？我连接了好久了都没连接上。我用的酶是TAKARA的，按照公司推荐的载体切2-3小时，800多bp的目的切2小时。两个酶buffer不一样，有10xT的公用buffer，反应温度也不一样，BamH I30℃，Sal I37℃，按照takara推荐的公用buffer以及37℃酶切，直接双酶切以及分步酶切都试过了，挑取的阳性克隆，提质粒后与原始载体大小接近，目的基因未连接成功 ，有没有什么方法能够证明双酶切切开了？ 1.png |
回复此楼» 猜你喜欢
筑牢营养安全线：以精准检测，护健康基石
已经有0人回复
-
推荐一些20种氨基酸检测的实际应用案例
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有256人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
14楼2016-08-04 10:15:50
2楼2016-03-23 11:26:48
原海亮
木虫 (著名写手)
- 应助: 232 (大学生)
- 金币: 4607.4
- 散金: 3521
- 红花: 33
- 帖子: 1804
- 在线: 375.4小时
- 虫号: 1392705
- 注册: 2011-09-06
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-08-04 06:43:14
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-08-04 06:45:11
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-08-04 06:43:14
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎发帖交流 2016-08-04 06:45:11
|
空载载体的处理确实容易出现这样情况，可以将回收后的载体重复二次酶切试试，保证酶切完全。或者可以找实验室心里构建好的pET+目的片段的载体，那它作为出发载体进行双酶切（当然这个载体上保留着你需要的双酶切位点），这样你回收载体时候，就可以同过看有没有目的条带切出来，来判断载体的酶切情况。第二，片段的处理，首先确定所选的酶为在目的片段里不存在，然后酶切处理同样要求尽可能的酶切完全，很多人为了避免后面出现类似麻烦的事情，可以把pcr产物连接T载体，一方面可以送测序验证是否正确后，再安排接下来实验。另一方面，这样做你酶切目的片段时候，就可以通过回收从T载体上切下来的片段进行连接转化，祝好！ 发自小木虫Android客户端 |
3楼2016-03-23 12:18:32
4楼2016-03-24 21:44:23