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新虫 (小有名气)

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[交流] 载体、目的基因双酶切、连接问题已有17人参与

各位大侠，帮我分析下PET-28a载体上用BamH I、Sal I酶切能切开吗？，序列见图。两个位点相差13bp，还有我在目的基因上设计酶切引物，引物前方只加了三个保护性碱基，这样子行不？我连接了好久了都没连接上。我用的酶是TAKARA的，按照公司推荐的载体切2-3小时，800多bp的目的切2小时。两个酶buffer不一样，有10xT的公用buffer，反应温度也不一样，BamH I30℃，Sal I37℃，按照takara推荐的公用buffer以及37℃酶切，直接双酶切以及分步酶切都试过了，挑取的阳性克隆，提质粒后与原始载体大小接近，目的基因未连接成功

，

有没有什么方法能够证明双酶切切开了？

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1楼 2016-03-23 10:30:53

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小静儿000

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我的实验也碰到了相同的问题，连了好久都没成功，后来实验室师兄教给我用同源重组的方法进行克隆，结果就连上了，而且目的片段不用酶切，直接把载体酶切之后用Dnp1酶消化一下就没有环状质粒了，不会有假阳性的，我用的是Vazyme的同源重组克隆试剂盒，你可以试试

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14楼2016-08-04 10:15:50

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原海亮

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空载载体的处理确实容易出现这样情况，可以将回收后的载体重复二次酶切试试，保证酶切完全。或者可以找实验室心里构建好的pET+目的片段的载体，那它作为出发载体进行双酶切（当然这个载体上保留着你需要的双酶切位点），这样你回收载体时候，就可以同过看有没有目的条带切出来，来判断载体的酶切情况。第二，片段的处理，首先确定所选的酶为在目的片段里不存在，然后酶切处理同样要求尽可能的酶切完全，很多人为了避免后面出现类似麻烦的事情，可以把pcr产物连接T载体，一方面可以送测序验证是否正确后，再安排接下来实验。另一方面，这样做你酶切目的片段时候，就可以通过回收从T载体上切下来的片段进行连接转化，祝好！

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