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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切
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雨中飞蝶

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切 已有5人参与

我现在想把目的基因构建到表达载体PET-30a中，选用的酶是Ecor1和Xho1，使用的Takara的快切酶。我是先将目的片段构建至PMD-18中，然后再同表达载体同时做双酶切，但每次T载体中目的片段可以切下来，但表达载体却切不开，不知道是怎么回事，时间、反应体系都是一样的。我想问一下，大家用过快切酶吗？反应时间一般都要多久，说明书说5min即可，但每次酶切效果都很弱，即使我延长到2小时，或是增加质粒的量，切下来的目的片段条带也很弱，而载体根本切不下来（载体上两酶切位点相距33bp)。大家有好的建议吗？或是遇到过类似的问题吗？
我的图片是TIFF格式，上传不上来.....
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1楼 2015-06-24 10:30:26
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

bright8

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-25 22:11:31
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-25 22:11:39
载体双酶切以后，跑胶看不大切下来的条带，太小了，建议你直接连接，再做菌落PCR就知道啦。我实验室用的酶都是NEB的，比Takara要好一点啦，说明书上15min，我一般切20h ，效果要好一点。按照说明书上，只有部分切开的。
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7楼2015-06-25 21:21:42
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sundan611

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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雨中飞蝶: 金币+4, ★★★很有帮助 2015-07-01 14:41:46
两个酶切位点只是相距33bp，你双酶切单凭跑胶根本看不出来有没有同时切开，不嫌麻烦保证连接成功最好就是分别单切，如果要是嫌麻烦想双切一次，你连接转化的时候就得好好做对照，要不然就是切不开怎么都是自连，你的目的片段切下来浓度低的话就得多切几管50ul体系至少6管，保证一定浓度，目的片段要是小的话浓度上不去也没事，因为你载体要是单切2次回收以后浓度也不会太高，在保证载体和目的片段都切开的情况下，多调节连接比例一定能行，一定要做好对照！
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9楼2015-06-26 16:05:55
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li201018

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-25 22:10:10
雨中飞蝶: 金币+1, ★有帮助 2015-07-01 14:41:06
很正常，表达载体很大，目的片段相对很小，有时候肉眼看不见双酶切的小片段，但是胶回收目的区域的胶，PCR验证还是有东西，我就遇到过此类情况。
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低调！务实！
2楼2015-06-24 11:21:26
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雨中飞蝶

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by li201018 at 2015-06-24 11:21:26
很正常，表达载体很大，目的片段相对很小，有时候肉眼看不见双酶切的小片段，但是胶回收目的区域的胶，PCR验证还是有东西，我就遇到过此类情况。

但是看不到东西，怎么判断条带出现的区域呢？
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3楼2015-06-24 16:08:57
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雨中飞蝶

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by li201018 at 2015-06-24 11:21:26
很正常，表达载体很大，目的片段相对很小，有时候肉眼看不见双酶切的小片段，但是胶回收目的区域的胶，PCR验证还是有东西，我就遇到过此类情况。

现在是目的片段能隐约看到，但是载体像是切不开....
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4楼2015-06-24 16:13:16
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li201018

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 雨中飞蝶 at 2015-06-24 16:08:57
但是看不到东西，怎么判断条带出现的区域呢？...

你直接用连接后的表达质粒为模板，跑PCR看有木有条带就知道表达载体有木有连接上目的条带。
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低调！务实！
5楼2015-06-24 16:28:45
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wuwenmei

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-25 22:11:03
载体双酶切电泳应该看不到被切开条带吧。切开就是十几个bp而已，你直接胶回收做连接看看能不能连上就好的嘛。
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下雨天就算没有伞，我也要学会努力奔跑！
6楼2015-06-25 14:29:34
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易水秋寒

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你确认载体上有EcoR I和Xho I的酶切位点吗？你再查查看吧，我看到的pMD-18载体序列上没有Xho I的酶切位点。
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8楼2015-06-26 08:31:30
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雨中飞蝶

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by bright8 at 2015-06-25 21:21:42
载体双酶切以后，跑胶看不大切下来的条带，太小了，建议你直接连接，再做菌落PCR就知道啦。我实验室用的酶都是NEB的，比Takara要好一点啦，说明书上15min，我一般切20h ，效果要好一点。按照说明书上，只有部分切开 ...

你是切20个小时？这么久，酶自身的活性不会失活吗？
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10楼2015-07-01 14:36:51
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