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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切
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雨中飞蝶

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切 已有5人参与

我现在想把目的基因构建到表达载体PET-30a中，选用的酶是Ecor1和Xho1，使用的Takara的快切酶。我是先将目的片段构建至PMD-18中，然后再同表达载体同时做双酶切，但每次T载体中目的片段可以切下来，但表达载体却切不开，不知道是怎么回事，时间、反应体系都是一样的。我想问一下，大家用过快切酶吗？反应时间一般都要多久，说明书说5min即可，但每次酶切效果都很弱，即使我延长到2小时，或是增加质粒的量，切下来的目的片段条带也很弱，而载体根本切不下来（载体上两酶切位点相距33bp)。大家有好的建议吗？或是遇到过类似的问题吗？
我的图片是TIFF格式，上传不上来.....
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1楼 2015-06-24 10:30:26
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雨中飞蝶

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by bright8 at 2015-06-25 21:21:42
载体双酶切以后，跑胶看不大切下来的条带，太小了，建议你直接连接，再做菌落PCR就知道啦。我实验室用的酶都是NEB的，比Takara要好一点啦，说明书上15min，我一般切20h ，效果要好一点。按照说明书上，只有部分切开 ...

你是切20个小时？这么久，酶自身的活性不会失活吗？
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10楼2015-07-01 14:36:51
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li201018

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-06-25 22:10:10
雨中飞蝶: 金币+1, ★有帮助 2015-07-01 14:41:06
很正常，表达载体很大，目的片段相对很小，有时候肉眼看不见双酶切的小片段，但是胶回收目的区域的胶，PCR验证还是有东西，我就遇到过此类情况。
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低调！务实！
2楼2015-06-24 11:21:26
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雨中飞蝶

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by li201018 at 2015-06-24 11:21:26
很正常，表达载体很大，目的片段相对很小，有时候肉眼看不见双酶切的小片段，但是胶回收目的区域的胶，PCR验证还是有东西，我就遇到过此类情况。

但是看不到东西，怎么判断条带出现的区域呢？
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3楼2015-06-24 16:08:57
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雨中飞蝶

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by li201018 at 2015-06-24 11:21:26
很正常，表达载体很大，目的片段相对很小，有时候肉眼看不见双酶切的小片段，但是胶回收目的区域的胶，PCR验证还是有东西，我就遇到过此类情况。

现在是目的片段能隐约看到，但是载体像是切不开....
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4楼2015-06-24 16:13:16
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