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雨中飞蝶

新虫 (初入文坛)

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[求助] 双酶切已有5人参与

我现在想把目的基因构建到表达载体PET-30a中，选用的酶是Ecor1和Xho1，使用的Takara的快切酶。我是先将目的片段构建至PMD-18中，然后再同表达载体同时做双酶切，但每次T载体中目的片段可以切下来，但表达载体却切不开，不知道是怎么回事，时间、反应体系都是一样的。我想问一下，大家用过快切酶吗？反应时间一般都要多久，说明书说5min即可，但每次酶切效果都很弱，即使我延长到2小时，或是增加质粒的量，切下来的目的片段条带也很弱，而载体根本切不下来（载体上两酶切位点相距33bp)。大家有好的建议吗？或是遇到过类似的问题吗？
我的图片是TIFF格式，上传不上来.....

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1楼 2015-06-24 10:30:26

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sundan611

铁虫 (小有名气)

应助: 13 (小学生)
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虫号: 2818417
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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
雨中飞蝶: 金币+4, ★★★很有帮助 2015-07-01 14:41:46

两个酶切位点只是相距33bp，你双酶切单凭跑胶根本看不出来有没有同时切开，不嫌麻烦保证连接成功最好就是分别单切，如果要是嫌麻烦想双切一次，你连接转化的时候就得好好做对照，要不然就是切不开怎么都是自连，你的目的片段切下来浓度低的话就得多切几管50ul体系至少6管，保证一定浓度，目的片段要是小的话浓度上不去也没事，因为你载体要是单切2次回收以后浓度也不会太高，在保证载体和目的片段都切开的情况下，多调节连接比例一定能行，一定要做好对照！