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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切，EcoR1和Not1，切T载体
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万法唯心

新虫 (小有名气)

[交流] 双酶切，EcoR1和Not1，切T载体 已有9人参与

37度，切24小时没有切开或者是弥散了，用的是EcoR1的buffer，30ul体系，质粒10，水13，buffer3，两个酶各2，体系有问题吗？还是条件不好？

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1楼 2016-01-08 17:05:50
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我是淡淡老师

新虫 (初入文坛)
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5楼2016-01-10 12:09:53
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反应链

新虫 (正式写手)
★
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NotI endonuclease works in single digestion? It is CpG Methylation sensitive.

According to Takara Products Catolog, double digestion with EcoRI and NotI should be supplied with BSA.
双酶切，EcoR1和Not1，切T载体
pMD18-T.jpg
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2楼2016-01-08 20:03:01
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xiangshengyan

木虫 (正式写手)
★
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use EcoRI-HF and NotI-HF; NEB Cut smart buffer 2 hours digestion is enough
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ANNA&KEVIN
3楼2016-01-09 11:38:07
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普通回帖

万法唯心

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiangshengyan at 2016-01-09 11:38:07
use EcoRI-HF and NotI-HF; NEB Cut smart buffer 2 hours digestion is enough

没有呀，我们只有thermo scientific的酶，请问我条件应该怎么改

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4楼2016-01-09 12:22:35
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632362481

铜虫 (小有名气)
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先测量一下提取的质粒浓度，浓度太高，量太大可能酶切不彻底，另外如果是快酶的话，就按照说明书来操作，酶切时间稍微长一点就好，除非有的酶显示不会出现星活性。
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。。。
6楼2016-01-10 14:20:07
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原海亮

木虫 (著名写手)
★
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首先，楼主先要确定质粒有没有问题，比如浓度如何，是否提取到。然后酶切的话时间太长，之前用慢酶的时候也只是五六小时吧，现在快酶半小时左右

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
7楼2016-01-10 23:17:19
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biocherry

铁虫 (正式写手)
★
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buffer  确定用对了？质粒酶切量太多？

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8楼2016-01-10 23:42:56
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万法唯心

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by biocherry at 2016-01-10 23:42:56
buffer  确定用对了？质粒酶切量太多？

就是用的EcoR1的buffer，应该没问题的，质粒加的10ul，今天又跑了一下，还是上面的体系，跑5个小时，结果完全没有条带，什么原因被降解了呢

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9楼2016-01-10 23:48:24
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基因操作工

新虫 (初入文坛)
★
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质粒浓度不明确。酶的品牌类型不明确。
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10楼2016-01-11 11:11:35
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