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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切，EcoR1和Not1，切T载体
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万法唯心

新虫 (小有名气)

[交流] 双酶切，EcoR1和Not1，切T载体 已有9人参与

37度，切24小时没有切开或者是弥散了，用的是EcoR1的buffer，30ul体系，质粒10，水13，buffer3，两个酶各2，体系有问题吗？还是条件不好？

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1楼 2016-01-08 17:05:50
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万法唯心

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by biocherry at 2016-01-10 23:42:56
buffer  确定用对了？质粒酶切量太多？

就是用的EcoR1的buffer，应该没问题的，质粒加的10ul，今天又跑了一下，还是上面的体系，跑5个小时，结果完全没有条带，什么原因被降解了呢

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9楼2016-01-10 23:48:24
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反应链

新虫 (正式写手)
★
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NotI endonuclease works in single digestion? It is CpG Methylation sensitive.

According to Takara Products Catolog, double digestion with EcoRI and NotI should be supplied with BSA.
双酶切，EcoR1和Not1，切T载体
pMD18-T.jpg
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2楼2016-01-08 20:03:01
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xiangshengyan

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
use EcoRI-HF and NotI-HF; NEB Cut smart buffer 2 hours digestion is enough
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ANNA&KEVIN
3楼2016-01-09 11:38:07
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万法唯心

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by xiangshengyan at 2016-01-09 11:38:07
use EcoRI-HF and NotI-HF; NEB Cut smart buffer 2 hours digestion is enough

没有呀，我们只有thermo scientific的酶，请问我条件应该怎么改

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4楼2016-01-09 12:22:35
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