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zhangtao110银虫 (小有名气)
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双酶切问题 已有3人参与
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这个质粒是商品化的质粒，不过被改造了，如图，多克隆位点用第一个（EcoR1）和最后一个(Hind 3)酶切开后除去了该多克隆位点，即用笔划去的部分，替换了上面的多克隆位点，上面这段多克隆位点的详细信息在下图中， 这个重组质粒目的是为了加上FLAG标签，用于后期目的蛋白的筛选，现在我提出了质粒，由于原质粒8958kb，切除多克隆位点又加上一段序列后大概10000kb左右，现在做双酶切，选了3×FLAG标签之前的唯一一个酶，即Spe1,XB3是原来他们实验室构建载体时加入的他们的目的基因，不用管，另一个酶选了Sma1,但由于双酶切切不开又换了一个酶，Sac1,意思就是Spe1与Sma1和Sac1搭配着双酶切，但是每次切过之后都发现只有一条带，原本要是双酶切都切开的话应该会有条800左右的条带，但是一直看不到，双酶切之后的电泳图片与对比的质粒电泳图片不同，于是我怀疑只有一个酶发挥了作用，于是想看看到底是哪个酶有问题，所以做了三种酶的单酶切，所有的电泳结果在下面，我会一一叙述每个条带 从左到右依次是超螺旋MARK,Spe1和Sma1双酶切，Spe1和Sac1双酶切，质粒（浓度和其它都一样，用来对比的），Spe1单酶切，Sac1单酶切，Sma1单酶切，15000kbMark.现在看来就是Spe1切得有问题，我用的体系是20ul，质粒10ul，10×M 2ul，1ul酶，加水补到20ul，大家给我分析Spe1单酶切怎么回事，为什么会出现三条带，是不是酶量不够，部分酶切了？还是有星活性和甲基化影响？下一步我该怎么做呢？谢谢  捕获.PNG  1.PNG  2015.01.21 meiqie flag.jpg |
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