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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 双酶切问题
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zhangtao110

银虫 (小有名气)

[求助] 双酶切问题 已有3人参与

这个质粒是商品化的质粒，不过被改造了，如图，多克隆位点用第一个（EcoR1）和最后一个(Hind 3)酶切开后除去了该多克隆位点，即用笔划去的部分，替换了上面的多克隆位点，上面这段多克隆位点的详细信息在下图中，
这个重组质粒目的是为了加上FLAG标签，用于后期目的蛋白的筛选，现在我提出了质粒，由于原质粒8958kb，切除多克隆位点又加上一段序列后大概10000kb左右，现在做双酶切，选了3×FLAG标签之前的唯一一个酶，即Spe1,XB3是原来他们实验室构建载体时加入的他们的目的基因，不用管，另一个酶选了Sma1,但由于双酶切切不开又换了一个酶，Sac1,意思就是Spe1与Sma1和Sac1搭配着双酶切，但是每次切过之后都发现只有一条带，原本要是双酶切都切开的话应该会有条800左右的条带，但是一直看不到，双酶切之后的电泳图片与对比的质粒电泳图片不同，于是我怀疑只有一个酶发挥了作用，于是想看看到底是哪个酶有问题，所以做了三种酶的单酶切，所有的电泳结果在下面，我会一一叙述每个条带
从左到右依次是超螺旋MARK,Spe1和Sma1双酶切，Spe1和Sac1双酶切，质粒（浓度和其它都一样，用来对比的），Spe1单酶切，Sac1单酶切，Sma1单酶切，15000kbMark.现在看来就是Spe1切得有问题，我用的体系是20ul，质粒10ul，10×M 2ul，1ul酶，加水补到20ul，大家给我分析Spe1单酶切怎么回事，为什么会出现三条带，是不是酶量不够，部分酶切了？还是有星活性和甲基化影响？下一步我该怎么做呢？谢谢

双酶切问题
捕获.PNG


双酶切问题-1
1.PNG


双酶切问题-2
2015.01.21 meiqie flag.jpg
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1楼 2015-01-23 16:47:31
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feimengzc

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhangtao110(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-23 21:49:53
应该是Spe1失活了，没起作用，那样质粒就没切开，跑出的是三条带，双螺旋，开环，线性
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淡然于心，从容于表，放开执念，随缘是最好的生活。
2楼2015-01-23 17:01:23
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zshw_001

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhangtao110(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2015-01-23 21:50:05
一般是没切开，多切一会或者酶切过夜，双酶切还要注意buffer合适不。
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永远相信未知的总是美好的！
3楼2015-01-23 17:53:08
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zhangtao110

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by feimengzc at 2015-01-23 17:01:23
应该是Spe1失活了，没起作用，那样质粒就没切开，跑出的是三条带，双螺旋，开环，线性

酶是新买的，可不可能是位点甲基化了呢

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4楼2015-01-23 18:19:01
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zhangtao110

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zshw_001 at 2015-01-23 17:53:08
一般是没切开，多切一会或者酶切过夜，双酶切还要注意buffer合适不。

是不是切开了部分，毕竟与未酶切的质粒电泳图不同了

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5楼2015-01-23 18:20:47
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红卫大兵

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得你可以在选择一下别的合适的酶切位点，有时候确实双酶切不好切
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6楼2015-01-23 21:32:45
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zhangtao110

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 红卫大兵 at 2015-01-23 21:32:45
我觉得你可以在选择一下别的合适的酶切位点，有时候确实双酶切不好切

可是我右边的酶切位点只有spe1一个呀！

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7楼2015-01-23 21:59:57
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2298827423

银虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1 2016-08-15 07:54:51
引用回帖:
7楼: Originally posted by zhangtao110 at 2015-01-23 21:59:57
可是我右边的酶切位点只有spe1一个呀！
...

我也遇到了同样的问题，请问您是怎么解决的，求回复，谢谢
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8楼2016-08-14 17:22:52
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