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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体质粒的双酶切
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郑凤席

新虫 (小有名气)

[求助] 载体质粒的双酶切 已有3人参与

我做的是Pcu19质粒的双酶切，酶切体系如下：质粒10μL，10×H Buffer 4μL，ddH2O2   22μL ，SaL I  2μL，EcoRI 2μL。另一管质粒的量为20微升恩，其中水的量变为12微升，其他的不变。
然后将其放入37度恒温培养箱培养3h，再在80摄氏度使酶失活，最后进行电泳检测。图片如下：从下往上看一次点的是：Marker，对照空载体，酶切之后的两个产物。
为什么酶切之后的条带比空载体的条带大呢？？我试过好多个体系，但没有一个酶切成功，请各位虫友帮帮忙！

载体质粒的双酶切


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1楼 2015-11-29 15:41:07
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匿名

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2楼2015-11-29 17:01:02
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mr.clutch

新虫 (小有名气)
图没看清，如果说切出来变得比超螺旋大的话很有可能是你的酶切是个单酶切，也就是其中一种酶没有发挥效用……如果两个酶的最适buffer不同的话，你可以两步酶切

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5楼2015-11-30 00:14:55
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吗子

金虫 (小有名气)
质粒是环状的，酶切之后成线状，线状跑得更慢，所以在后面。双酶切理论上可以切出目的条带来，但看你的结果，更多的是单酶切产物。2ul的酶量也多了点吧。建议你减少酶量，20ul体系，1ul酶足够了，延长一下酶切时间，4-5h。
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深秋
13楼2015-12-02 08:58:54
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普通回帖

郑凤席

新虫 (小有名气)
我的载体是大于2000的，本来是环状的，我要线性的，所以要切开，但我做了很多次改了很多次体系都切不开

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3楼2015-11-29 22:06:08
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郑凤席

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 弦山小栗 at 2015-11-29 17:01:02
你的图上的都表示什么？看酶切位点，你切下的片段是多大？要是确认没有问题的话，质粒的状态可能是两种，一种是环状的，一种是线性的，环状的跑的快，大小不能完全根据琼脂糖电泳结果判断。希望对你有帮助。
...

从下到上为Marker，对照空载体，酶切之后的两个产物。

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4楼2015-11-29 22:06:48
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郑凤席

新虫 (小有名气)
这两个酶的Buffer是一样的，反应温度也一样，我都不知道怎么做下去了。

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6楼2015-11-30 08:20:51
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Demon黄

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
郑凤席: 金币+8, ★★★很有帮助 2015-12-01 14:39:58
酶切过后肯定是会比空载体大的，因为你连接上外源片段了，而且线性的肯定比环状的大，你可以看下你那个酶切片段大小和你连接上的大小一不一致。会不会是你的质粒载体酶切位点缺失了。建议你把你的空载体也双酶切一下（那两个酶所切的位点是在质粒上的话，就用这两个酶切一下）。因实验室是用的loadingbuffer终止酶切反应。
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7楼2015-11-30 18:06:44
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郑凤席

新虫 (小有名气)
可是酶切之后的质粒载体比没有酶切过的质粒载体还要大没道理啊，应该是环状的比线状的大吧。还有我的目的片段是850bp的，载体是大于2000bp的，如果连接上了应该不会只比酶切的大一点点吧？

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8楼2015-12-01 08:28:16
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zcliang2014

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
郑凤席: 金币+2, ★★★很有帮助, 不知为啥他只能给1～2，本来我是要给9的～～ 2015-12-01 14:41:15
1 环状质粒凝胶电泳一般会出现三种构象：超螺旋，这种迁移速度最快，也是看到最多的；接近线状的，这种构象在凝胶中与酶切后的线状DNA迁移率一致；负超螺旋，这种质粒是开环的，迁移速率最慢，在凝胶中看起来比线状DNA要大。从你的图片来看，你的质粒是被切成线状的了。
2 如果你要纠结没有检测到目的片段，那有一种可能是没有连入目的片段，他也是个空载体；另一种可能是连入目的片段，但没有切下来，这有可能是其中一个酶切位点破坏，或一个没失活；建议你将质粒分别做个单酶切，检测一下位点/酶 是否正常。
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9楼2015-12-01 11:11:00
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fuyulin

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
酶加的太多了，0.25足够了，老板看了会心疼死，酶多不是啥好事，几十纳克的DNA几个单位足矣
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10楼2015-12-01 12:22:27
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